一种重组蛋白肽图分析方法与流程

作者：杨超月

一种重组蛋白肽图分析方法与流程

本发明属于肽图分析技术领域，具体为一种重组蛋白肽图分析方法。

背景技术：

肽图分析(peptidemapping)是蛋白多肽药物质量控制的重要手段之一，是根据蛋白的分子量大小以及氨基酸组成特点，利用酶裂解法或化学裂解法，将蛋白质大分子裂解成较小片段，并通过一定的分离检测手段形成特征性图谱的过程。它对于蛋白质类药物结构研究和特性鉴别具有重要意义，已成为蛋白多肽类药物质量标准控制的常规指标之一。

对于重组蛋白质药物的肽图检查，2015年版《中国药典》三部采用的方法一般为trypsin裂解-反相高效液相色谱法，早期本项目的肽图谱分析直接按照药典的方法进行，虽然单次实验样品与对照品肽图谱具有较好的一致性，但其肽图谱部分峰分离度明显不够，而且不同时间实验得到的峰谱存在一定的差异，认为是由于此重组蛋白分子结构复杂，由多条肽链组成，且链间及链内含有多对二硫键，按中国药典直接进行胰酶裂解和常规梯度洗脱，因结构位阻效应和片段较多，很难酶解充分并得到理想的裂解峰图，为此，发明人综合各方面因素提出了一种重组蛋白肽图分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于：为了解决背景技术涉及的技术问题，提供一种重组蛋白肽图分析方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种重组蛋白肽图分析方法，包括如下步骤：

s1、样品配制：包括s101、取重组蛋白对照品和待测样品，超纯水溶解或稀释，使终浓度为1mg/ml；s102、胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶5mg，超纯水溶解，浓度为1mg/ml，分装于ep管中，50μl/管，-20℃储存备用；s103、100mmol/lnh4hco3溶液，称取nh4hco3395.3mg，超纯水溶解并定容至50ml；s104、10％tfa溶液：取tfa溶液100μl于ep管中，加入900μl超纯水，混匀，备用；

s2、配制平衡色谱柱的流动相组；

包括s201、配制流动相a：100％超纯水(含0.1％tfa)溶液：取洁净量筒，量取超纯水1000ml于蓝盖瓶中，加入tfa1.0ml，混匀，超声30min，备用。

s202、流动相b：90％乙腈(含0.1％tfa)溶液:取洁净量筒，量取乙腈900ml，超纯水定容至1000ml，加入tfa1.0ml，混匀，超声30min，备用。

s203、流动相c：100％乙腈，取适量乙腈(约500ml)，超声30min，备用；

s204、流动相d：100％超纯水，取适量超纯水(约500ml)，超声30min，备用；

s3、样品处理：取洁净1.5mlep管，加入100mmnh4hco3溶液200μl，待测样品200μl，同时做标准对照和空白对照，混合均匀后于100℃沸水浴加热30min；加热完毕后取出至4℃冰箱冷却5min，按照酶底比1:50，加入4μl胰蛋白酶溶液，混合均匀于恒温水槽37℃反应1h；然后加入20μl10％tfa溶液终止反应，混合均匀后离心处理，并取上清液150μl于液相进样瓶中，待hplc进样分析；

s4、hplc检测，包括s401、hplc设备开启：预先冲洗色谱柱，然后用初始洗脱流动相a平衡色谱柱20min至基线平稳，备用；

s402、样品检测：按照下色谱条件首先平衡色谱柱80min，然后进样检测；

s5、结果处理：将对照品及供试品图谱进行重叠比较，保存结果；

s6、结果判定，空白对照在4～60min之间应无明显吸收峰，待测样品应与对照品肽图谱一致，则待检样品合格，反之不合格。

作为本发明进一步技术方案：s3、样品处理中离心处理，采用离心机，且转速为10000rpm离心10min。

作为本发明再进一步技术方案：所述s401中按照《waterse2695型高效液相色谱仪标准操作规程》开启仪器并完成溶剂管理系统准备，连接所需色谱柱。

作为本发明再进一步技术方案：所述s401中预先冲洗色谱柱，用50％超纯水-50％acn冲洗色谱柱10min，流速为1ml/min。

作为本发明再进一步技术方案：所述s402中色谱条件：色谱柱，symmetry300tmc18(5μm，4.6×150mm)；柱温，30±5℃；流速，1ml/min；检测波长，214nm；进样体积，80μl；运行时间，76min。

作为本发明再进一步技术方案：所述s5中重叠条件：90度重叠，间距为0。

作为本发明再进一步技术方案：还包括s7、检测后处理：样品检测结束后，用下色谱洗脱方法冲洗色谱柱，然后用100％acn冲洗hplc四管路，确保各管路冲洗干净后，关闭仪器和电源。

作为本发明再进一步技术方案：所述色谱柱一周内不再使用则拆下色谱柱，至于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：