Phi29 DNA聚合酶

作者：张馨予

本酶是从Bacillus subtilis噬菌体Phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。Phi29 DNA聚合酶具有高效的DNA合成能力，可连续合成多达70kb的DNA片段。同时该酶具有3′→5′外切酶校读功能，保真性高，还具有特殊的链置换和连续合成特性。

产品组成：
组份JN0020-125Uphi29 DNA聚合酶125UdNTP混合液（各10mM）200μl10×phi29 Buffer1ml

产品特点：
1、极高的掺入率。
2、超强的链置换能力。
3、保真性高。
4、中温下反应。

产品用途：
1、恒温protein-primed DNA扩增。
2、利用随机引物扩增DNA。
3、滚环复制。
4、复制extended-region。

注意事项：
1、该酶缓冲液中含有还原剂DTT以便保证其最大酶活性。故如果缓冲液不新鲜或经过反复冻融，使用前应添加4mM的DTT。
2、要求高扩增效率的反应，请选择百奥莱博蛋白质工程改造的升级版super phi29 DNA聚合酶（JN0019）。

应用：菌液测序模板制备
优点：无需细菌培养、收集、裂解和质粒DNA的分离与纯化，不需要离心机和PCR仪。
样品预变性：挑取单克隆，参考右侧反应体系热变性。
质粒扩增：按下面反应条件进行，如选用百奥莱博super phi29 DNA聚合酶（JN0019）反应时间可缩短到1小时*
热失活：65℃，10分钟。
测序反应：取上述反应液2μl加8μl双蒸水，即可用于直接测序。

常用反应体系（50μl）
10×phi29 Buffer5μl随机引物（1mM）1.25μl质粒模板（1μg/ml)1μl加ddH2O至45μl,95℃预变性3min，冰上冷却。dNTP(各10mM)2.5μl100x BSA0.5μlphi29 DNA Pol2.5μl30℃过夜

质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

活性定义：在30℃条件下，10min内能使0.5pmol的dNTP掺入酸不溶性物所需要的酶量定义为1个活性单位。

10×反应缓冲液：500mM Tris-HCl（pH7.5）,100mM MgCl2，100mM (NH4)2SO4，40mM DTT。反应时需要加入dNTP。

储存条件：-20℃
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