核糖体rDNA ITS序列

作者：张馨予

核糖体 rDNA ITS 序列

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　　近年来随着分子生物学的发展，同时也是真菌学自身发展的客观需求，分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入地应用。一些因形态复杂、生理生化不稳定等原因分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了验证。某些重要的病原真菌遗传信息得到阐明，并在群体遗传变异、抗病育种、地理生态等方面得到应用。

　　目前，真菌核酸序列研究几乎都集中在rRNA基因上，因为rDNA 存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，同时客观存在的不同区域进化水平不同，可以用于不同分类等级的研究。用于扩增rDNA不同区域的保守引物已设计成功，并广泛用于菌物系统发育研究中。

　　以下为：目前真菌基因组核糖体DNA(rDNA)的基因间隔区ITS序列在真菌学研究中的现状的一些概述。

1、ITS特征

内转录间隔区ITS 位于18S和5.8S rDNA(ITSl)之间以及5.8S和28SrDNA之间(ITS2)，在18S rDNA基因上游和28S rDNA基因下游还有外转录间隔区ETS。ITS和ETS区的转录物均在rRNA成熟过程中被降解。ITS和ETS包含有rDNA前体加工的信息，在 rRNA成熟过程中有着相当重要的作用。非转录区又称基因间隔区IGS，它将相邻的两个重复单位隔开，在转录时有启动和识别作用。整个rDNA基因簇从5'到3'，端依次为基因间隔区IGS(包括在18S rDNA基因上游的ETSl和在28SrDNA基因下游的ETS2)；位置可变的5SrDNA基因；18S rDNA基因；ITSl序列；5.8S rDNA基因；ITS2序列，以及28S rDNA基因。

2、ITS序列在真菌分子系统学研究中的应用

　　18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究。18S rDNA和28S rDNA分别约为1.8kb和3.4kb，序列中既有保守区又有可变区，在进化速率上比较保守，其中18S比28S基因更保守，是在系统发育中种级以上阶元的良好标记。5.8S基因分子量小且高度保守，较少用于系统学研究。但它为真菌rDNAPCR扩增的通用引物的设计提供了极大的方便。

　　由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。

　　目前使用ITS区作为分子标记的主要方法有DNA序列测定分析和PCR-RFLP分析。

　　Belloch等使用ITS序列测定分析技术，分析了分别属于Kluyveromyces aestuarii，.dobzhanskii，k. lactis，k. marxianus，k. nonfermentans和k.wickerhamii六个种的39个菌株以研究它们的分子进化关系，在分子水平上鉴别了k. lactis的两个变种k. lactis var．1actis和k. lactis var．drosophila-rum。目前认为，前者主要为分离自乳制品的乳糖阳性菌株，后者则由昆虫和植物分泌物中分离得到的乳糖阴性菌株。 Belloch等的结果表明，目前认为的K lactis实际上是一个包含不同种、亚种的复合菌群。Trichophyton是一类能侵入角质化组织中并引起癣病的真菌，共有40多个种。人们曾使用基因组DNA的C+C含量、线粒体DNA的RFLP分析，以及18S、28S确rDNA序列比较等方法对其进行研究，但仍有部分种难以鉴定。 Graoser等使用ITSl和ITS2两个区间的序列成功地研究了该属的53株菌，结果将它们分别归为38个种并通过形态学及生理生化特征证实了ITS序列分析的可行性。Chen等应用ITS序列对来自40个种的141株酵母真菌进行了分子系统学研究。通过自动毛细管电泳对菌株ITS序列PCR产物的分析发现：由ITS-1区序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为19个种，由ITS-2区序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为 16个种，而ITS全序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为30个种。进一步通过对ITS-1序列测序分析则可将其准确地分为40个种。

　　在国内的研究中ITS序列的应用也取得了很大的进展。祝明亮等利用PCR-RFLP方法对捕食线虫真菌节丛孢属、隔指孢属进行了系统发育研究，结果体现了属内不同种间的亲缘关系，从分子水平证实了节丛孢属、隔指孢属形态分类学的合理性，同时对节丛孢属的属征扩大提出疑义[12，13]。 Trichoderma．harzianum是木霉属内最常见的一个“集合种”，章初龙等[14]对来源不同的T.harzianum及其相似种的46个菌株进行了ITS序列测定，结果表明，T.harzianum及其相似种可分成A、B2个群：A群由T.hamatum、T.asperellum、 T.atroviride、T.koningii和T.viride组成，并形成2个分支；B群由T.spit-ale、T. inhamatum、T.harzianum、T. hamatum和T.aFlam组成，并形成6个分支。陈永青等””采用随机扩增多态性技术和核搪体基因rDNA转录间隔区ITS序列分析，对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究。可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来，但分自同科或同届寄主植物上的不同的种并不具有相近的亲缘关系。另外，对相同的供试菌株两技术所反映的亲缘关系趋势相同，表明两技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定均是可行的。

3、ITS序列在真菌病原学研究中的应用