T细胞的灵敏度和特异性

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

抗原特异性检测试剂与 CD19.CAR 的抗原结合域结合，与非抗原特异性检测试剂相比，应该具有高特异性和低背景染色。然而，它们很昂贵并且只能用于一种特定的 scFv。

CD19.CAR 检测试剂 (Miltenyi) 构成一种基于生物素化抗原的融合蛋白，可通过与荧光染料偶联的抗生物素抗体进行检测。它由人CD19 胞外域和突变的人 IgG1 Fc区组成。据制造商称，突变的人IgG1 Fc区不需要Fc受体阻断，并允许在低背景下染色。FITC标记的人类CD19 (20-291) 蛋白 (AcroBiosystems) 是一种重组蛋白。目标抗原已经预先用荧光染料标记。

通用CAR检测试剂，如抗Fab抗体和蛋白L，是非抗原特异性的，因此可用于不同设计和抗原特异性的CAR。两者都针对IgG样片段。虽然它们更具成本效益，但另一方面它们的特征可能是更高的背景染色。

抗小鼠IgG Fab抗体与G类免疫球蛋白的Fab部分结合。通过对整个免疫球蛋白进行胃蛋白酶消化，大部分Fc片段已被去除，从而产生具有两个抗原结合区的二价 F(ab’)2片段，通过二硫键连接。由于Fc片段的丢失，可以大大减少与Fc受体的非特异性结合。由于这些是多克隆抗体制剂，不同批次的结果可能会有很大差异。

源自大消化链球菌的蛋白L可选择性地与大多数免疫球蛋白轻链（κ 链）亚型结合，而不会干扰抗原结合位点。该蛋白质具有广泛的免疫球蛋白结合活性，包括对Fab片段的亲和力，与类别特异性重链无关。郑等人已经证明了这一点。适用于多种CAR，包括抗EGFRvIII、抗 CD19和抗HER2。它与单链抗体片段 (scFv) 结合而不干扰免疫球蛋白的抗原结合位点，使其能够检测CAR的细胞表面表达。在用荧光染料偶联的链霉亲和素染色之前，包括多个洗涤步骤以避免在洗涤缓冲液中残留蛋白质L是很重要的。

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关键试验结果

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3.1. 四种不同检测试剂的比较

通过四种不同的 CAR-T 细胞检测试剂对 5 名患者和 5 名 HD 制造的 CAR-T 细胞进行染色。根据染色方案对样品进行染色，并使用相应的非转导对照获得至少100,000 个事件（补充材料图 S1）。使用直方图设置设置阳性CD19.CAR的门，CAR 阳性和阴性群体由两个不同的峰分隔。

图 S1：检测试剂比较的门控策略。来自HD的CAR-T细胞样本的代表性门控策略，用于分析不同的检测试剂。所有存活的单细胞都被门控CD3阳性，然后分析CD19.CAR表达。

图 S2：灵敏度测量的门控策略。来自HD的CAR-T细胞样本的代表性门控策略，用于分析不同检测试剂的灵敏度。所有可行的单细胞都针对CD3阳性和CD14阴性进行门控。然后针对其 CD19.CAR 表达对这个亚群进行门控。

图S3：特异性评估的门控策略。用于分析不同检测试剂特异性的HD外周血样本的代表性门控策略。所有可行的单细胞都针对CD20和CD14阴性进行门控。然后进一步分析这些细胞的CD3阳性和CD56阴性，最后分析其CD19.CAR 表达。

如图2所示，所有试剂都可以用CD19检测试剂检测CAR，CD19蛋白和L蛋白显示出阳性和阴性群体的明显区分。CAR-T 细胞的百分比在检测试剂之间有所不同。CD19 CAR检测试剂和 F(ab’)2 片段产生了最高频率的CAR-T细胞。这些观察结果与来自健康供体 (HD) 和患者的 CAR-T 细胞一致。

图 2. 检测CD19特异性CAR-T细胞的四种不同抗体的比较。两张图都显示了使用展示的染色试剂时CAR-T细胞检测的不同百分比。(A) 描述了从五个不同的HD样本中产生的CAR-T细胞的百分比。(B) 显示了从五个不同的患者样本 (Pat) 产生的CAR-T细胞的百分比。(C) 显示了用所有四种不同抗体染色的一种HD的CAR-T细胞的等高线图。非转导细胞的门限与相应的 CD19.CAR-T 细胞组相同。分别在三个独立实验中评估HD和患者样本的比较。

3.2. 灵敏度

为了检查不同试剂的灵敏度和检测水平，CD19 特异性 CAR-T 细胞以六种不同的稀释度（1:0、1:1、1:5、1:10、 1:50、1:100、1:1000）。用四个 HD 产生的 CAR-T 细胞重复实验。排除死细胞后，分析CD3+/CD14-细胞的 CAR 表达（补充材料图 S2）。通过流式细胞术获得最少 150,000 个事件。

所有检测试剂在整个稀释1:1到 1:100 中都显示出类似的染色模式（图 3A）。通用检测试剂和CD19蛋白在 1:1000和PBMC组中都显示出更高的背景染色。即使在非常高的稀释度（50:1、100:1、1000:1）中，CD19 CAR 检测试剂也能对 CD19 CAR 阳性细胞进行特异性染色，如图 3B 所示。