领域奠基之作：Cell 重磅报道可胞外展示的糖基化

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

利用多糖代谢标志物标记细胞内 RNA

研究人员此前开发了基于代谢物标记和生物正交化学的方法，利用叠氮化物基团的前体糖来标记细胞或动物，从而发现蛋白质相关多糖。在利用其标记唾液酸前体（Ac4ManNAz）时，发现标记细胞中高度纯化的 RNA 中存在叠氮化物反应，提示潜在的多糖化 RNA 存在。

为了探究唾液酸化多糖修饰的 RNA（glycoRNA）是否存在，研究人员利用 Ac4ManNAz 标记 HeLa 细胞，然后提纯高纯度的 RNA，随后通过变性凝胶电泳分离和印迹分析，发现标记信号是时间依赖的，并且 DNase 处理并不影响 glycoRNA 信号，而 RNase 处理的影响可被抑制剂 SUPERaseln 阻断，表明 Ac4ManNAz 处理标记了细胞中 RNA。

随后研究人员在其他细胞类型中进一步证实了这种现象。

为了进一步评估是否可以在体内进行标记，研究人员对小鼠进行不同时间的腹腔注射，结果发现与细胞培养中一致的 glycoRNA，表明 glycoRNA 不仅是组织培养的人工产物，而且是广泛存在于多种细胞和组织类型的。

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glycoRNAs 是一类非编码 RNAs

由于变性凝胶电泳发现 glycoRNA 的迁移非常缓慢，因此研究人员推测 glycoRNA 可能是聚腺苷化（poly-A）的大 RNA。然而研究人员始终无法通过 poly-A 富集纯化 glycoRNA。于是研究人员利用长度依赖的 RNA 沉淀和结合硅胶柱，从小到大进行分离。有趣的是，glycoRNA 只与总 RNA 中一部分小 RNA 分离。

研究人员用蔗糖梯度和 SYBR Gold 染色分析标记的 RNA 分布，结果发现分离的是小 RNA/tRNA，18S rRNA 和 28S rRNA。

为了鉴定 glycoRNA 的转录本，研究人员利用蔗糖梯度从标记的 H9 和 HeLa 细胞中分离出小 RNA 片段。研究人员发现尽管细胞类型不同，但是 HeLa 和 H9 细胞 glycoRNA 的富集呈高度正相关，因此富集定义了 193 个 RNA 转录本为潜在的 glycoRNA。

研究人员发现在被修饰的 RNA 中有许多已知的和发挥关键作用的 RNA，其中 Y RNA 家族最为显著。因此，研究人员通过 CRISPR/Cas9 敲除来验证 Y5 为 glycoRNA。与野生型细胞相比，Y5 KO 细胞的标记信号量显著下降，与测序数据 glycoRNA 信号减少一致，表明 Y5 是富集最多的。

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在 glycoRNA 中检测标记和无标记的唾液酸

Ac4ManNAz 代谢主要是转化为唾液酸，然后变为 CMP - 唾液酸添加在多糖的末端。为了排除 Ac4ManNAz 转入其他代谢途径的可能性，研究人员使用 9Az - 唾液酸（可直接转化为 CMP - 唾液酸）作为代谢标记。

与先前的结果一样，9Az - 唾液酸产生同样的缓慢迁移的 RNA。使用霍乱弧菌的唾液酸酶（VC-Sia）处理标记的 RNA 会导致信号完全消失，而加热失活 VC-Sia 则不能。

研究人员为了探究唾液酸合成酶的作用，通过使用抑制剂 P-3FAX-Neu5Ac 处理，导致 glycoRNA 信号剂量依赖性减少，并在印迹中向更高的表观分子量转移，表明 glycoRNA 流动性降低是由于唾液酸减少。

为了确定 glycoRNA 是唾液酸化的，研究人员使用高效液相色谱荧光定量检测荧光探针 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene (DMB，衍生化游离唾液酸)，在细胞的总 RNA 中进行标记，发现了动物中常见的两种唾液酸形式 Neu5Ac 和 Neu5Gc。而当样品被 VC-Sia 或 RNase 处理时，则检测不到，进一步证实 glycoRNA 被唾液酸修饰的。

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经典的 N - 多糖合成机制有助于 glycoRNA 的产生

蛋白质上有两类主要的多糖，N - 多糖和 O - 多糖，两者都可以被唾液酸化。

研究人员使用遗传学、药理学和酶学的结合方法进行检测，探索 glycoRNA 结构是否与糖蛋白相关多糖结构相关。

IdID CHO 细胞系不能产生 UDP-Gal 和 UDP-GalNAc，所以抑制 N - 多糖和 O - 多糖。研究人员发现 Ac4ManNAz 处理 IdID CHO 细胞中基本没有 glycoRNA 标记。添加半乳糖而非 GalNAc 恢复了标记，同时添加进一步提高标记强度。这些结果表明 glycoRNA 多糖在结构上与蛋白质上发现多糖相关。