免疫印迹的基本原理、实验步骤及 FAQ

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

1. Western blot 结果中的背景为什么较高?

可能的原因及建议

1) 膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。

2) 一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

3) 一抗孵育的温度偏高——建议 4℃结合过夜。

4) 膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。

5) 检测时曝光时间过长——减少曝光时间。

6) 二抗与封闭剂非特异性结合或反应——设置二抗对照(不加一抗)。

7) 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应——在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。

8) 未结合蛋白质洗涤不充分——增加洗涤次数。

9) 膜的选择导致的高背景——NC 膜比 PVDF 膜背景低。

2. Western blot 结果中杂带较多

可能的原因及建议

目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。

样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

上样量过高，太敏感——适当减少上样量。

一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。

一抗不纯——纯化抗体

一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同——使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。

检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白——查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。

条带为非特异性条带——应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。

靶蛋白形成多聚体——SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。

结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议

1) 检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

2) 检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，不低于20-30ug，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

3) 转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

5) 一抗孵育时间不足或一抗不足或一抗失效——建议 4℃结合过夜，使用高浓度抗体，使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。

6) 二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。

7) 洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1%的弱去垢剂 Tween-20。

8) 封闭剂和一抗或二抗有交叉反应——使用使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。

9) 二抗受叠氮钠抑制——避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。

3. 其它现象：

1) 膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合，过滤封闭剂。

2) 反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高，稀释抗体的浓度。

3) 蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

4) 分子量蛋白标准条带呈黑色——抗体和分子量蛋白标准发生了反应，在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。

5) 目的条带染色过低/过高——分离不彻底，改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。

6) 相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带——制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀，参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。

4. “微笑”条带

1) 迁移速度过快——降低电泳电压。

2) 电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）——降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。

5. 凝胶染色不均匀

1) 细菌污染——4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。

2) 抗体量不足——确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。

6. TBS 与 PBS 的区别