生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法

作者：张馨予

　　摘要：　生物碱是天然产物中药用活性较好的一类化合物, 在分离科学与技术领域, 生物碱的分离一直是一个研究热点和难点问题。近年来, 随着高效液相色谱填料和分离方法的发展, 生物碱的分离分析和纯化制备有了长足的进步。该文主要针对碱性化合物的峰形拖尾问题, 综述了高效液相色谱理论的发展和色谱分离技术的进步, 以及近年来新型色谱填料和分离方法在生物碱分离分析和纯化制备中的应用, 并对其前景进行了展望。

　　关键词：　生物碱; 拖尾; 制备色谱; 正交分离;

　　Abstract：　Alkaloids are a class of natural compounds with good pharmacological properties.In the field of separation science and technology, alkaloid separation has always been a hot and difficult problem.In recent years, with the development of high performance liquid chromatography (HPLC) materials and separation methods, great progresses in alkaloid analysis and preparation have been achieved.In this article, the theoretical development and technological advances with respect to peak tailing problems of basic compounds are summarized, and the applications of HPLC in natural alkaloid analysis and preparation are discussed.The further development of HPLC separation on alkaloids is also looked forward.

　　Keyword：　alkaloids; peak tailing; preparative HPLC; orthogonal separation;

　　生物碱是天然产物中药用活性和成药性较好的一类化合物, 据统计, 美国FDA批准的1 000多种小分子药物中, 碱性药物的比例超过60%[1]。在目前已发现的天然产物中, 生物碱在总数上虽然只占16%, 但在具有重要药理活性的天然产物中占50%, 是天然产物新药开发中最具潜力的一类化合物[2]。

　　从19世纪初开始, 植物化学家就一直致力于生物碱的纯化制备, 通过溶剂萃取、硅胶柱层析、结晶等植化手段获得了大量生物碱, 并开发出众多的碱性药物[2,3,4]。但由于传统技术的局限, 对生物碱分离纯化往往收率很低, 特别是含量较低的成分极易丢失, 还有许多结构类似的生物碱, 也因为分离度不够而无法获得纯品。高效液相色谱是在传统柱层析基础上, 采用细颗粒的球形硅胶基质键合固定相和高压泵输液方式发展起来的具有柱效高、分离能力强、重复性好、速度快等系列优点的现代色谱分离方法, 目前已成为药物分析、食品科学、生命科学等学科和产业领域不可或缺的重要分析工具[5]。随着分析型高效液相色谱的普及, 制备型高效液相色谱也得到了越来越多的发展[6]。在天然产物领域, 制备型高效液相色谱被广泛应用于黄酮、皂苷、生物碱等成分的纯化分离[7,8,9], 特别是在结构类似物的分离中起到了重要作用, 直接推动了许多新化合物的发现[10,11,12,13,14]。

生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法

　　然而相比于其他类型天然产物, 生物碱的分离往往会出现峰形拖尾和载样量特别低的情况, 不仅在传统硅胶柱上死吸附严重, 在高效制备填料上也依然是令人头疼的问题[15,16]。由于峰形拖尾, 生物碱往往峰宽较宽, 峰高较矮, 检测灵敏度较差, 而提高进样量又会导致色谱峰拖尾加剧, 柱效迅速下降, 相邻的成分更易被拖尾峰包裹, 这些问题给生物碱的分离分析和纯化制备带来了许多困难。

　　针对像生物碱这样的碱性化合物的特殊色谱保留行为, 研究者们从流动相和固定相上作了一系列探索并取得了一定进展。本文将主要从碱性化合物的高效液相色谱峰形拖尾的形成机理和相应改善方法, 以及实际应用, 生物碱的分离分析和纯化制备进展等方面进行综述。

　　1、碱性化合物峰形拖尾的内在机理讨论

　　在过去几十年中, 许多研究者对碱性化合物的色谱峰拖尾行为展开了研究并提出了相应的观点, 其中主要有硅醇基理论、带电溶质相互排斥理论和多位点吸附理论。

　　1.1、硅醇基理论

　　硅醇基理论[17]是最早用于解释碱性化合物在硅胶基质固定相上拖尾现象的理论。该理论认为, 硅胶基质表面残留的酸性硅醇基与碱性化合物之间的离子交换作用, 是导致碱性化合物拖尾的主要原因。在C18等反相填料的键合过程中, 由于空间位阻的存在, 硅醇基往往不能完全反应, 即使采用短链硅烷试剂进行封尾, 仍有大量硅醇基未反应[15]。特别是在早期色谱填料制备过程中, 使用了Type A类硅胶基质, 存在较多的金属离子残留, 会进一步激发硅醇基的酸性, 进而导致碱性化合物拖尾[18]。为此, 色谱填料和色谱柱生产厂商通过改进球形硅胶基质的生产工艺, 并发展了多种封尾技术[19,20]。随着高纯硅胶 (纯度>99.99%) 和封尾技术的普遍应用, 硅醇基的活性大大降低, 如Neue等[21]以锂离子 (Li+) 的保留为指标对Waters公司的多种硅胶基质及其C18键合色谱柱的硅醇基酸性进行评价时发现, 在pH 3.0～7.0范围内, 高纯硅胶基质反相色谱柱 (Symmertry C18和XTerra MS C18) 对锂离子均无保留, 说明其阳离子交换作用在酸性条件下几乎可以忽略。但在实际应用中, 即使在此类高纯硅胶色谱柱上开发碱性化合物的分析方法, 仍经常需在流动相中添加磷酸盐等缓冲盐或其他试剂来改善峰形。另外, 研究发现在不含硅醇基的聚合物色谱柱上, 离子化碱性化合物依然出现了拖尾和易过载现象[22] (图1) , 而且在硅胶基质的反相色谱柱上, 强酸性化合物也会表现出与碱性化合物类似的峰形拖尾和展宽现象[23], 表明生物碱的峰形拖尾显然还存在硅醇基以外的因素。