生物反应器应用于组织工程的进展与前景趋势

作者：杨超月

宋麟祥
(工研院生医中心生医材料暨组织/工程技术组研究员)

■一、前言

组织工程是生物医学工程领域中一个快速发展的分支，它融合了细胞生物学和工程学的原理，目的在开发具生物活性的组织替代物，期能修复受损组织或是再生。由于组织工程对象是人体组织，细胞和组织块之体外培养条件必须仿生地接近人体内环境，因此生物反应器即为良好的应用工具，除在种子细胞增殖、组织块建构培养扮演重要角色外，生物反应器尚能控制pH、溶氧、机械应力、营养供给及代谢物移除等条件，为细胞的生长、分化和发育分化提供最适宜的环境。本文将介绍组织工程生物反应器的应用进展与开发前景。

■二、种子细胞、组织块与生物反应器

(一)种子细胞扩增

使用组织工程种子细胞须考虑三个重点：(1)适当的细胞密度(即单位体积所需细胞数量)。Goshima等(1)将体外培养的骨髓间充质干细胞，按不同密度复合于多孔陶瓷植入体内，结果显示植入物的骨髓间充质干细胞密度须在2×107/cm3以上才能确保新骨形成。另外，当软骨细胞植入的密度低于1×107/cm3个时，会产生很少软骨或软骨无法生成(2)，可见种子细胞密度对培养的影响性。(2)良好的种子细胞分化程度。单层培养造成细胞去分化，并容易形成细胞团，造成细胞形态变为细长，不具备块状组织的生理特征，产生的ECM量少且质量差。虽然培养在三维支架后，细胞分化状态可部分恢复，但往往恢复不完全，因而直接影响组织块的质量(3)。(3)控制种子细胞扩增培养条件。如神经干细胞可以在微重力条件下，维持圆形的细胞形态进行扩增。种子细胞扩增培养的关键问题，在于控制生长条件(如溶氧浓度及pH值)及足量的营养供给(4)。

(二)利用生物反应器培养组织块

人体细胞仿生性地生长在三维支架(载体)中，除了比二维培养大幅增加细胞贴附的表面积外，也增加了生长因子供给效率和细胞外基质(ECM, extra cellular matrix)的合成量，有利于细胞朝多方向迁移、分化和大量增殖(5,6)。

另外，三维多孔结构也有利于氧气和营养物质的传输、代谢产物的排出，以及保持载体内部细胞旺盛的代谢活性(7)。单层细胞平盘培养之营养来源一般不受限制，这是因为依赖营养液的扩散，足以通过单层细胞10μm左右的厚度，但是当组织块的厚度超过100~200μm时，氧气和营养的扩散就会受到明显限制。实际上患者的组织或器官缺损的体积，往往远超过这个门坎，平盘培养既然无法有效率提供足量的种子细胞，便突显出生物反应器的重要性。它提供的动态培养环境使其内部培养液流动，并使支架内的氧及营养质传更充分，更利于代谢废物排出，并能使细胞分布更均匀，细胞基质分泌更多，细胞表型表达更充分(8,9)。

Freed等(10)利用生物反应器，在直径6.7mm、厚5mm的支架材料上培养出软骨组织块，II型胶原蛋白的含量占总胶原蛋白量的9%以上。Hoerstrup等(11)利用脉动生物反应器培养骨髓间充质干细胞的三尖瓣组织，其结构与机械性能亦接近人体三尖瓣。

■三、组织工程生物反应器的进展

(一)组织工程对生物反应器的要求

动物细胞尺寸在10~30mm之间，比增殖速率较慢(约0.06hr-1)，倍增时间长(约12hr)。以生物反应器培养的细胞密度为106个/mL(约0.3g/L)，较高细胞密度为108个/mL(约30g/L)。细胞的耗氧量较大[约0.3mmol/(L×hr)]，其最大值可达到30mmol/(L×hr)。组织工程生物反应器的培养参数，除了配合前述细胞的特性及需求外，须满足以下的基本要求：生物反应器的设计应方便于培养液的均匀混合，并提供精确的控制，使各营养成分和培养液的pH值梯度尽量减少，此动态培养的方式乃为了使支架(即组织块)内的氧及营养质传更充分，代谢产物更容易排出，细胞表型更充分地表达。培养液混合方式应使剪应力对细胞的损伤降到最低。若为干细胞分化之大量培养，必须注意精准控制干细胞在不同的分化阶段所需不同的生长因子浓度。生物反应器设计要能接近体内发育情况，而体内各种组织和器官所处环境各异，某些种类细胞要求反应器能提供一定的机械应力，如肌腱在体内主要承受张应力，而骨骼主要承担压应力，心血管主要承受脉动式应力，其它可能的物理影响因子尚有磁场、电场等。因此，生物反应器的设计必须能因应不同组织，提供「专一性」的需求。此外，为满足较大体积组织建构对种子细胞数量的需求，常将生物反应器与微载体细胞培养技术结合。由于微载体有较大的比表面积，相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数十倍甚至上百倍的细胞。微载体培养细胞可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。因此，生物反应器还需要保持种子细胞与微载体在培养过程中良好的结合。尽管对组织工程反应器有上述苛刻的要求，现阶段使用的反应器，大部分是在既有动物细胞反应器上作少部分的改进，虽然基本上能符合培养需求，但由于专一性不强，甚至存在很多问题，因此生物反应器在组织工程领域还有很大的创新和发展空间。

(二)组织工程的生物反应器种类

(a)搅拌式生物反应器