DNA的变性、复性与分子杂交

作者：杨超月

DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA的重要特性枣变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系又有重要意义。

1.DNA变性(denaturation)

指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变：

溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。

溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。

核酸的解链曲线

15－8　核酸的解链曲线

增色效应(hyperchromiceffect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。

对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型(图158)。可见DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm,meltingtemperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G＋C所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：

Tm=69.3＋0.41(%G+C)

一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。

2.DNA复性(renaturation)

指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响：

温度和时间。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。

DNA浓度。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大。

DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。在核酸复性研究中，定义了一个Cot的术语，(Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间)，用以表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重缔合部分(在时间t时的复性率)对Cot作图，可以得到如图15－9所示的曲线。曲线上方为示复杂性的核酸分子的非重复碱基对数。如多聚(A)的复杂性为1，重复的(ATGC)n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是105核苷酸对的非重复DNA的复杂性为105。原核生物基因组均为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接体现基因组大小(图上方的箭头所指为基因大小)，对于真核生物基因组中的非重复片段也是如此。在标准条件下(一般为0.18ml/L阳离子浓度，400核苷酸长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值(称Cot1/2)，与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物核酸分子，此值可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲线更为复杂。

不同物种核酸的Cot曲线

图15－9　不同物种核酸的Cot曲线

DNA的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)技术等。

3.分子杂交：(hybridization)