【求助】microRNA 原位杂交相关问题

作者：杨超月

各位高手，小弟最近在做有关miRNA石蜡切片的原位杂交，定的Exiqon两端标记的，买的博士德的原位杂交试剂盒，做了几次都做不出来，杂交温度为55度，请问一下你们都用的什么试剂盒啊，exiqon的试剂盒买不起啊太贵了。还有就是按照exiqon公司网上的protocal原位杂交液根本配不出来的啊
配方：50%Formamide, 5xSSC, 0.1%Tween, 9.2 mM citric acid for adjustment to pH6, 50 ?g/mL hepa- ?
rin, 500 ?g/mL yeast RNA) ，ph值调到6.0总体积肯定超过的啊根本配不出来。
我的详细步骤：

准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加80ml 蒸馏水即可。

0.5 M PBS — — 1000ml 蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4 · 12H2O 6g, NaH2PO4 · 2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序：

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC 处理，以抑制RNA 酶对mRNA 的分解作用.

石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 MPBS，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm 的小块，固定1 小时即可，较大的标本固定不要超过2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40 分钟，一定不要超过1 小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2 室温处理10 分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤2 次。

4．暴露mRNA 核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3--30 分钟（视标本厚薄、新旧自行调整）。充分的消化可以使mRNA 得到暴露，从而增强杂交信号；但另一方面，过度的消化又使切片明显减薄乃至消失，从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同，这就需要用户比较不同的消化时间，例如10 分钟，20 分钟，30 分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS 洗3次×5 分钟。蒸馏水洗1 次。

6. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml 以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱55℃2—4 小时。吸取多余液体，不洗。

7. 杂交——用杂交液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/ml。按每张切片加20μι杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱55℃杂交过夜。
8. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC 洗涤5 分钟×2 次；0.5×SSC洗涤15 分钟×1 次；0.2×SSC 洗涤15 分钟×1 次。必要时可重复0.2×SSC 洗涤1 次。
9.滴加封闭液：37℃30 分钟。甩去多余液体，不洗
10.滴加生物素化鼠抗地高辛： 37℃60 或室温120 分钟。0.5M PBS 洗5 分钟×4 次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11.滴加SABC：37℃20 分钟或室温30 分钟。0.5M PBS 洗5 分钟×3 次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20 分钟或室温30 分钟。0.5M PBS 洗5 分钟×4 次。
13.DAB 显色：使用DAB 显色试剂盒—1ml 蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C 各一滴，混匀，加至标本上。镜下控制显色，一般在30 分钟内。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB 显色剂后显色。充分水洗。
14.必要时苏木素复染，充分水洗。
15.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

各位高手帮帮忙啊！