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第十一章 多肽药物分析
一、前言
二、合成多肽药物药学研究的基本考虑
三、合成多肽药物药学研究的主要内容
（一）制备工艺研究
（二）结构确证研究
（三）制剂处方工艺研究
（四）质量研究与质量标准
（五）稳定性研究
一、前言
1.1多肽类药物产生的背景:
20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；
多肽固相合成技术
高效液相色谱（HPLC）纯化
分析技术的发展
1.2合成多肽药物概念:
指采用化学合成方法制备的多肽类药物。包括采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。
1.3化学合成在多肽分类:
纯天然多肽：
经结构修饰的天然多肽:
增加多肽与受体的亲和力、选择性;
对酶降解的抵抗力、改善药代动力学特性;
甚至由受体的激动剂变为拮抗剂;
人工设计出的多肽:
多肽固相合成和组合化学产生了肽库，短时间内获得大量的多肽化合物
药物筛选的效率不断提高
获得多肽类药物的可能性提高
二、合成多肽药物药学研究的基本考虑
1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑
目前主要有液相合成和固相合成两种方法。
液相合成:逐步合成或片段缩合方法。
逐步合成法:
片段缩合:
液相合成的优点:
中间产物纯化、中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失
缺点是较为费时、费力等。
固相合成:
优点
简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等
缺点
每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。
液相合成法较适于合成短肽；
固相合成法更适于合成中、长肽。
2、关于多肽结构确证研究的考虑
氨基酸组成分析、质谱、氨基酸序列测定等对其结构确证有重要意义。
对于具有一定空间结构才能发挥其活性的多肽，应进行必要的立体化学研究。
3、关于多肽制剂处方工艺研究的考虑
合成多肽药物制剂研究的总体目标和要求与其它类型化学药物制剂是一致的，即通过一系列研究工作，保证制剂剂型选择依据充分、处方合理、工艺稳定、生产过程得到有效控制，并能实现工业化生产。
但是，由于多肽药物的生物活性可能和其空间结构相关，多肽分子中存在大量的酰胺键，另外还可能有羧基、羟基、氨基、巯基等较为活泼的基团，较易水解或降解，因此了解合成多肽药物的物理化学稳定性和生物学稳定性对选择适宜的剂型和合理的处方、制备工艺有重要作用。
4、关于多肽药物质量研究的考虑
多肽药物质量研究与其它类型化学药物基本一致。
不同之处在于:
氨基酸组成分析；中、长肽要做效价、免疫原性和抗原活性等研究。
注意工艺杂质:
缺失(不完全)肽、断裂肽、去酰胺多肽、氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物、氧化肽、二硫键交换的产物、非对映异构的多肽、低聚物和/或聚合物
毒性试剂和溶剂
5、关于多肽药物稳定性研究的考虑
多肽药物不稳定的原因:
水解、氧化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。
稳定性研究应根据多肽药物稳定性的特点合理选择试验条件、考察项目。
三、合成多肽药物药学研究的主要内容
原料药的制备工艺研究
结构确证研究
制剂的处方工艺研究
质量研究和质量标准的制订
稳定性研究
（一）原料药制备工艺研究
1、工艺选择
根据目标肽的结构、自身生产条件等考虑选用液相合成或固相合成工艺。
均需要提供:
化学反应式、工艺流程图、操作过程等，对工艺参数（如投料量、反应条件、反应试剂）要有详细的描述，包括对于多肽的修饰（例如二硫键的形成等）。
2、起始原料、试剂的质量控制
氨基酸及其衍生物
氨基酸及其衍生物的质量标准一般应包括:
性状、熔点、比旋度、化学纯度、色谱纯度及光学纯度、含量等，其中化学纯度和光学纯度的控制尤为重要。
如果使用了特殊的氨基酸或其衍生物，申报资料中还应提供其合成工艺及结构研究的相关资料。
树脂
采用固相合成方法制备多肽，应提供树脂的来源、质量标准和检验报告，并对树脂的摩尔取代系数、在不同溶剂中的膨胀系数、所用合成条件下的稳定性情况、交联度等予以说明。
常用树脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物等，应根据目标多肽C末端氨基酸的不同类型（如羧酸型、酰胺型等）选择特定用途的树脂，并说明选择的依据。
3、工艺的过程控制
（1）反应终点监控
液相合成属于常规有机合成，一般可采用色谱法(如TLC法、HPLC法)监测；
固相合成偶合反应的终点可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸（TNBS）法和四氯苯醌等监测。二硫键连接的终点可用Ellman试验或HPLC法监测。
（2）中间体质量控制
液相合成：
缩合片段：比旋度、熔点和纯度等进行控制。
较长序列的中间体：氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、质谱、比旋度等。
固相合成：一般无中间体分离过程。但如果多肽从树脂上切割后还需进行后续反应，对中间体的质量也要进行相应控制，同时还要进行相应的结构研究。
4、分离和纯化
多肽纯化的方法包括：
重结晶、逆流分布、电泳、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱等。
常见的纯化方法：凝胶柱脱盐，制备型高效液相色谱纯化。
样品的干燥方法：常用冻干法，如果多肽对温度不敏感，也可采用室温或高温干燥。
申报资料纯化方法应包括：
详细的验证性资料例如纯化前后样品的代表性色谱图以说明纯化效果。
提供详细的纯化过程和相关的工艺参数。
纯化工艺的研究可结合质量研究中杂质分析方法的验证进行。
（二）结构确证研究
多肽结构研究的主要目的：
是要说明其氨基酸组成，序列是否正确，多肽分子中如有半胱氨酸，应明确其状态（氧化态或还原态），对含有多个半胱氨酸的多肽，应明确二硫键的正确连接位点。对于长肽，需要对其空间结构（例如二级、三级结构）进行研究。
短肽：
元素分析、红外光谱、核磁共振谱、氨基酸组成分析、质谱等常见方法，氨基酸序列测定。
中、长肽：
氨基酸组成，氨基酸序列分析。（Edman降解，质谱：分子量及其序列信息，是对Edman降解的很好补充。）
中、长肽的结构研究中，尽管紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱等能够提供的可供分析的信息有限，但在一些情况下，上述研究还应考虑进行。例如，在可获得结构确证对照品时，进行上述谱图的对比测定，对于说明所研制产品的结构有重要意义；对于全新结构的多肽，进行上述研究，也可为说明多肽结构提供辅助信息，并为质量研究和质量标准的制订提供信息。
当多肽中含有非天然氨基酸及氨基酸衍生物时，结构研究中应予以证明。此时，应在相应的研究中，考察这些非天然氨基酸及氨基酸衍生物的色谱行为。
（四）质量研究与质量标准
1、质量研究
原料药的质量研究
研究项目一般包括：
外观性状、理化常数、鉴别、氨基酸组成分析、水分、反离子含量、纯度、有机溶剂和反应试剂残留量、生物学安全性检查、含量和/或活性效价测定等。
对于合成多肽药物，除常规项目外，理化常数一般需要关注其比旋度、等电点（pI）、溶解性（主要为水和缓冲液中）等。
氨基酸组成分析、反离子（例如三氟醋酸或醋酸根）含量、反应试剂残留量（例如从树脂上裂解多肽使用了氢氟酸，需要检查氟化物残留量）等，则需要在原料药质量研究中予以重视。
相关肽检查（或称有关物质检查）：
RP-HPLC，（HPIEC）、毛细管电泳技术，高效分子排阻色谱（HPSEC）、（PAGE）以及激光散射粒度测定等技术。
有关物质检查的方法学验证应能证明所采用的方法可以有效分离目标多肽与工艺杂质（例如缺失肽等）、降解产物（例如二硫键交换或氧化产物等）、聚合物等。一般应考察两种以上不同原理的方法，高效液相色谱法至少应包括一种梯度洗脱方法，并采用多肽粗品和强制降解试验等对方法的专属性等进行考察、对比，此外还应注意研究多波长检测的结果并选择合适的检测波长等
合成多肽因结构特征不同于通常的小分子化学药品，纯度检查有时难以从根本上有效控制产品安全性，需要进行必要的生物学安全性检查（如过敏试验、降压物质、升压物质、异常毒性等）以全面控制产品质量、保证安全性。此外，根据产品具体情况，对于长肽，有时尚需进行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。
含量测定
评价多肽质量的重要指标之一，理化方法测定其含量时称为“含量测定”，生物学方法或酶化学方法测定其效价时称为“效价测定”。对于短肽，理化方法测得的含量可以反映其有效程度时，首选简单、通用的含量测定方法；对于具有一定空间结构才能发挥其活性的多肽，需进行生物学方法或酶化学方法测定药物活性（效价）的研究，包括含量与活性的关系、相应的方法学验证等。
（2）制剂的质量研究
合成多肽制剂的质量研究基本思路和要求可参照《化学药物质量标准建立的规范化过程指导原则》、《化学药物制剂研究指导原则》等相关内容，根据合成多肽的具体特点，在原料药质量研究的基础上，结合剂型特点、处方工艺以及临床使用特点，重点研究所用辅料和制剂工艺对产品质量的影响、制剂辅料和制剂产生的降解产物对检测方法的影响以及与剂型相关的质量要素。研究项目一般亦应包括性状、鉴别、检查（安全性、均一性、纯度要求与有效性指标等）、含量或效价测定等几个方面。
2、质量标准
原料药质量标准应包括氨基酸组成、等电点、中长肽的肽图等。
合理可行的质量标准应能有效控制产品质量以保证临床用药的安全性和有效性，并有效地控制药品批间质量的一致性。
《化学药物杂质研究技术指导原则》。
（五）稳定性研究
合成多肽药物稳定性研究的基本原则应遵循《化学药物稳定性研究的技术指导原则》的一般性要求。
与一般化学药物相比，多肽药物的稳定性较差。
稳定性研究应根据多肽药物稳定性的特点合理选择试验条件、考察项目。
加速试验和长期留样试验的试验条件应依据药物对温度、湿度和光照等条件的敏感程度考察（影响因素试验）基础上选择；考察项目除常规项目（例如原料药的比旋度、有关物质和含量等）外，根据具体情况，可能还需要考察其生物活性的变化。
与其他化学药物不同，多肽药物可能具有一定程度的表面活性，有与直接接触药品的包装材料和容器发生吸附等相互作用的可能，从而引起制剂效价、生物活性下降。例如有些多肽分子能够与玻璃表面的硅醇基发生相互作用。因此，在包装材料的选择方面需注意其与多肽药物相互作用的研究，有些情况下可选择特殊处理后的包装容器，如表面经硅烷化处理的容器等。
多肽药物药代动力学特点
生物半衰期短
蛋白多肽类药物进入体内后可以被酶迅速代谢降解，半衰期通常很短，如血管紧张素II的半衰期<l min，胰岛素在人体半衰期<9 min，组织纤溶酶原激活物为26～55min。
具有首关效应
蛋白多肽类药物直接口服给药，在经过胃肠道和肝脏时会被部分代谢，使得进入体循环的药量减少。如胰岛素首次经过肝脏有40％ 一50％的药量被清除。故早期蛋白多肽类药物往往采用非口服给药，如注射给药、鼻腔给药、眼部给药等 但口服给药是最方便的给药方式，尤其适用于长期用药，所以，研制口服蛋白多肽类药物逐渐成为发展的主要趋势。
生物利用度低
由于蛋白多肽类药物的生物半衰期短，加上胃肠道和肝脏的首关效应等原因，其生物利用度通常较低。特别是口服给药，因其分子量大，不易被动转运吸收，使其生物利用度更低，一般只有10％ 左右。
影响蛋白多肽类药物药动学参数的主要因素
结合蛋白的影响
蛋白多肽类药物会和体内某些特异性蛋白结合。这些特异性的蛋白往往会在细胞水平上调节蛋白多肽类药物的效能，并可影响这类药物的药动学行为，特别是可影响其体内清除和体液分析。这些结合蛋白可以作为一种储存库使药物的体内存留时间延长，也可作为清除机制加速这类药物的清除。
对给药方案依赖性
给药方案可影响蛋白类治疗药物的药效动力学，特别是蛋白激素类，这些激素生理情况下的分泌具有生理节律性，外源性蛋白治疗剂不同给药速率和方式可产生不同的作用。
蛋白的免疫原性
象所有的蛋白那样，蛋白类治疗药物亦具有免疫原性，从而可诱发机体产生抗体。抗体除可中和蛋白药物的生物活性外，还可影响蛋白药物的体内分布、代谢和排泄。
内源性干扰
一个主要的影响因素是不少蛋白类治疗药物就是机体中存在的物质，特别是蛋白激素，细胞因子等。这些内源性成分对外源性蛋白的药物动力学产生干扰，因而在阐明给予的外源性蛋白药物的确切药动学时，内源性物质的影响必须予以控制。
分析方法
生物检定法
多肽类药物的生物活性不仅取决于药物的一级结构，而且与二、三级结构密切相关。生物检定法用于研究该类药物的药动学的独特性及检定标记药物的生物活性，主要有在体分析和离体分析两大类。
在体分析法分析多肽类药物在整体动物中引起的特异生物学反应；离体分析法通常用细胞体外培养技术，以细胞增殖、分化或细胞毒性为基础，以细胞数的增减为量效指标。
免疫学方法
多肽类药物是一种抗原或配体（或受体），有相应的抗体或受体（或配体），用免疫学方法及受体配体结合法可定量测定其免疫活性或结合活性。
免疫学方法测定的是多肽的免疫活性而不是生物活性，不能同时测定代谢物，具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差，也易受内源性物质干扰。
放射性同位素标记法
放射性同位素标记法是研究多肽类药物的主要工具，分为外标法和内标法。蛋白质中如含有酪氨酸或赖氨酸等适宜的氨基酸，可用外标法（将标记物如125I以化学方法偶联至完整蛋白质中），常用的有氯胺T法；外标法不可行时可用内标法（将标记3H，14C或35S等同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系中，获得含同位素的多肽分子）。内标法因操作复杂而少用。
同位素标记示踪法与其他分析手段的联合检测
同位素标记示踪法与其他手段联合包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）、三氯醋酸沉淀（TCA）、HPLC法。
色谱分析
肽谱图分析是控制多肽药物质量的重要手段。肽谱图对每一种多肽药物都是特征的、专一的，因此可鉴别多肽，预测其一级结构特征。
肽谱分析根据多肽Mr大小和氨基酸的组成特点，将蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点，将多肽裂解成较小片段，通过相应分离检测手段得到特征性指纹图谱。用于色谱分析的有HPLC、高效毛细管电泳法（HPCE）、凝胶电泳法等。
核磁共振法
核磁共振法（nuclear magnetic resonance， NMR）主要用于核定多肽的微观理化性质，还可提供三维结构信息，NMR谱检测的某些指标可以反映多肽的生物功能特别是酶促反应动力学过程。
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