基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建

作者：张馨予

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一种以猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)为病原体的疾病，可造成仔猪和育成猪呼吸障碍、母猪流产，具有较高的致死率，给全世界养猪产业造成巨大经济损失[-]。目前关于PRRSV的研究多集中于病毒学特性、病毒的起源、进化以及猪体对其产生的免疫应答等方面[-]，而关于PRRSV如何依赖宿主因子完成吸附、入侵、RNA脱壳、核酸蛋白质等生物大分子合成、子代病毒组装和释放生活周期的分子机制的研究尚不充分。

组织蛋白酶(cathepsin)是在各种动物组织的细胞内(特别是溶酶体部分)发现的一类蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员，在生物界已发现20余种，人体中主要存在11种，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶[-]。研究表明cathepsin与多种病理过程相关，例如cathepsin G通过切割白细胞介素6受体、水解活化细胞因子等途径参与血管性炎症、急性肺损伤等炎症性疾病的发生[]；由于cathepsin D的表达水平与胃癌的淋巴结转移之间的相关性，其表达水平的变化可以作为胃癌预后的判断指标之一[]。而cathepsin在病毒复制周期中的作用也陆续被发现，例如埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)入侵宿主细胞时，需要借助cathepsin B和cathepsin L使病毒表面糖蛋白构象改变从而使病毒可以将遗传物质“注入”宿主细胞[-]；在肝癌细胞中，乙肝病毒的x基因(HBx)表达量与cathepsin S的表达量正相关，在瞬时过表达HBx的HepG2细胞中，HBx可能是通过上调cathepsin S的表达量促进细胞增殖[]；PRRSV通过激活NF-κB通路和cathepsin L来上调乙酰肝素酶的表达，降解硫酸乙酰肝素从而促进病毒的释放[]。由此，笔者推测其它组织蛋白酶也可能参与PRRSV的生活周期。本研究构建了针对猴源cathepsin基因的shRNA真核慢病毒表达载体，与包装质粒(pMD2.G, psPAX)共同转染HEK293T/17细胞后收取慢病毒上清液，感染源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感)，获得高效且稳定敲减cathepsin基因的细胞株。该稳定细胞系的建立为后续探究cathepsin在PRRSV生活周期中的作用奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

pLKO.1载体、慢病毒包装载体psPAX2、pMD2.G、Ampicillin和Puromycin购自Sigma公司；人胚胎肾细胞HEK293T/17购自ATCC公司；猴胚胎肾上皮细胞Marc145来自河南省动物免疫学重点实验室；PRRSV-GFP毒株由西北农林科技大学周恩民教授馈赠；DMEM、FBS以及胰酶购自Gibco；Prime Script RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、rTaq酶、DL10000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoRⅠ-HF、AgeⅠ-HF及T4连接酶购自NEB公司；Lipofectamine®3000 Transfection Kit购自Promega公司；质粒中提试剂盒为QIAGEN产品；TOP10大肠杆菌感受态为实验室自制。引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA测序由上海英潍捷基生物公司完成。

1.2 方法 1.2.1 猴源cathepsin基因shRNA重组质粒的构建和鉴定

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种进化上保守的抵御外来病毒或转基因的防御机制[-]。将与靶基因mRNA同源的双链RNA (double strand RNA, dsRNA)导入细胞，shRNA的发卡结构可被细胞切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNA上并将其特异性地降解，从而产生相应的功能表型缺失[-]。本研究利用慢病毒载体把shRNA导入细胞，其在感染后可以整合到细胞的基因组上；并且载体中的U6启动子确保了shRNA长时间表达；这种整合的shRNA序列可随细胞DNA一起复制并被传递到子代细胞中去，从而使靶基因长期稳定沉默。

首先，查找NCBI数据库得到非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)的全部cathepsin基因；然后，使用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iT RNAi Designer，针对每种猴源cathepsin基因设计3条长度21 bp的shRNA序列，每条序列作用于不同靶点。shRNA退火形成双链，与pLKO.1载体(经EcoRⅠ-HF、AgeⅠ-HF处理)连接成重组质粒(如)；转化大肠杆菌，37 ℃振荡培养1 h，涂布于含100 μg·mL-1 Ampicillin的固体LB培养基倒置培养过夜。次日挑选阳性单克隆，以菌液为模板，PCR扩增鉴定插入片段。菌液PCR上游引物：5′-TCGACGGTATCGATCACGAGACTAG-3′；下游引物：5′-AATTGTGGATGAATACTGCCATTTG-3′。阳性结果经上海英潍捷基生物公司测序正确后，按照中提试剂盒说明书抽提质粒，置于-20 ℃保存备用。

图 1(Figure 1)

Figure 1

图 1 shRNA表达原理 Figure 1 Illustration of shRNA

1.2.2 慢病毒颗粒包装