5p宿主靶基因cDNA文库的构建及鉴定

作者：杨超月

马立克病(Marek’s disease, MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染鸡引起的一种肿瘤性免疫抑制性传染病[]。MDV属于疱疹病毒科, α-疱疹病毒亚科, 马立克病毒属。依据生物学特性的不同, MDV可分为血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(HVT)三种血清型[], 而在最新的病毒分类中又被重新命名为禽疱疹病毒2型(GaHV2)、禽疱疹病毒3型(GaHV3)和火鸡疱疹病毒Ⅰ型(MeHV1)[]。其中, 仅MDV-1具有致病性和致瘤性。目前, 虽然可以用疫苗较好地预防MD肿瘤发生, 但由于疫苗免疫压力及病毒自身进化等原因, MDV流行毒株的毒力正不断增强[]。MDV感染鸡群后不仅导致宿主免疫抑制, 而且可快速诱发肿瘤及大批鸡死亡, 因此MDV感染被认为是研究疱疹病毒致病和致肿瘤的理想模型[]。

microRNA(miRNA)是一类长度为21~25 nt的非编码小分子RNA, 它们在细胞的发育与分化、细胞凋亡、肿瘤发生等许多生物学过程中调控蛋白编码基因的转录后表达水平[-]。MDV-1共编码26个成熟体miRNA, 其中miR-M4-5p与宿主miR-155具有相同的种子序列, 是miR-155的同源物[]。由于miR-155参与调控许多肿瘤的形成过程, 被认为是致癌基因[-], miR-M4-5p可能也发挥着类似的重要作用。最近的研究表明miR-M4-5p在MDV致瘤性方面直接发挥着重要作用。敲除miR-M4-5p的MDV致病和致瘤能力显著减弱[]，但具体的作用机制仍然不是十分清楚。此前通过生物信息学软件预测和试验验证, 我们已证实LTBP1是miR-M4-5p一个重要的宿主靶基因[]。由于生物信息学方法预测miRNA的靶基因存在候选分子众多、筛选及鉴定工作量大等缺点, 本研究采用hybrid-PCR的策略构建miR-M4-5p的宿主候选靶基因cDNA文库[], 通过双荧光素酶报告试验(dual fluorescence reporter assays, DLRA)分析miR-M4-5p与候选靶基因的相互作用, 为进一步揭示miR-M4-5p的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 细胞

HEK 293T细胞由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)分离自7~8日龄SPF鸡胚。

1.2 主要试剂、载体

TRIzol Reagent，购自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase、Premix TaqTM、DNA限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ、PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser、DNA Ligation kit和pMD19-T(simple)vector, 均购自宝生物工程(大连)有限公司；DLRA系统, 购自Promega公司；Annealing Buffer for Oligos(5×), 购自碧云天巴西vs瑞士让球公司；psiCHECK-2和pcDNA6.2-miR-neg载体, 由中山大学徐辉博士馈赠；pcDNA6.2-miR-M4-5p、pcDNA6.2-mut-miR-M4-5p质粒和菌种[], 由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室构建并保存。

1.3 引物合成

本研究使用的DNA引物均使用Premier Primer 5.0软件设计, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名称、序列等相关背景信息见。

表 1(Table 1)

表 1 用于扩增或合成候选靶基因3′-UTR的引物 Table 1 Primers used for amplifying the wild type or mutated 3′-UTRs of putative mRNA targets

编号
No. 引物名称
Primer name 序列(5′-3′)
Sequence (5′-3′) 扩增长度/bp
Amplicon
1 CSNK2A2-3′-UTR-F
CSNK2A2-3′-UTR-R CTCGAGATTCACAGTTGCCTCCT
GCGGCCGCGAATATGGAATGTAAACAGAT 199
2 PDK3-3′-UTR-F
PDK3-3′-UTR-R CTCGAGGGCTTCTGACAGTGGGA
GCGGCCGCAAAACATCAAGTAATCTC 199
3 PRICKLE1-3′-UTR-F
PRICKLE1-3′-UTR-R CTCGAGTCCCTGAATTTGAAGAA
GCGGCCGCGACCCATAAATAACACT 242
4 SEPT2-3′-UTR-F
SEPT2-3′-UTR-R CTCGAGAAGTGAGACCACCATTC
GCGGCCGCAAGCTCTGCAAATTCAA 175
5 PPFIBP1-3′-UTR-F
PPFIBP1-3′-UTR-R CTCGAGTTCTACTCCAAACACCCTG
GCGGCCGCTTACGTTGCCCTCTTCA 196
6 COLA-3′-UTR-F
COLA-3′-UTR-R CTCGAGACCCAACTTGCTTTCAT
GCGGCCGCTTACAGAGCAGCCATCC 205
7 WWTR1-3′-UTR-F
WWTR1-3′-UTR-R CTCGAGTGTCCTCAGGCTTCGTT
GCGGCCGCCTGGTACTGGCAGATGG 242
8 BCAT1-3′-UTR-F
BCAT1-3′-UTR-R CTCGAGTACTGGATAAACTAAAGGAA
GCGGCCGCTTGATGAGGAAAACTGC 204
9 MMP2-3′-UTR-F
MMP2-3′-UTR-R CTCGAGTTTGCTTCCTGCACTTT
GCGGCCGCTGAGAAACATTCCATCA 220
10 RCN1-3′-UTR-F
RCN1-3′-UTR-R CTCGAGATCTGTTCTGAATGCTAAAG
GCGGCCGCCTACAGGGAGAGCATAAACC 225
11 ANTXR1-3′-UTR-F
ANTXR1-3′-UTR-R CTCGAGGAATGGGATTTGGTGAG
GCGGCCGCGCTTCAGATTTATGGGTT 181
12 PELI2-3′-UTR-F
PELI2-3′-UTR-R CTCGAGGTCCCTTCTGCTTCCAT
GCGGCCGCCTTCCACGGGTACAACA 244
13 TECPR1-3′-UTR-F
TECPR1-3′-UTR-R CTCGAGGACTGAGGGTGCTGTAG
GCGGCCGCGATTTTATTTGGATGAGC 162
14 VAPB-3′-UTR-F
VAPB-3′-UTR-R CTCGAGGCAAGATTCTTCTGCCTCC
GCGGCCGCCATCAAACAGGATTGGTCTT 181
15 CIRBP-3′-UTR-F
CIRBP-3′-UTR-R CTCGAGATGGACACTGGGCTTGG
GCGGCCGCCGTTGGCTTTCCTGCTC 212
16 RFXAP-3′-UTR-F
RFXAP-3′-UTR-R CTCGAGTGGTGGAGGTGCTTGCT
GCGGCCGCCACAAAACAATTCTTGGTCC 227
17 TBC1D9B-3′-UTR-F
TBC1D9B-3′-UTR-R CTCGAGGTGCTGAAGGCAAGGAG
GCGGCCGCTACAGGGCAGAGGAGGC 187
18 NT5C3A-3′-UTR-F
NT5C3A-3′-UTR-R CTCGAGGAATAAGCCGCGTGCATGGG
GCGGCCGCAAGAAAAATATGTATGAAAA 189
19 ITGB5-3′-UTR-F
ITGB5-3′-UTR-R CTCGAGAGTTGTGCTCGTGGATT
GCGGCCGCAACTCTTGTATCCTAATTTC 241
20 CARHSP1-3′-UTR-F
CARHSP1-3′-UTR-R CTCGAGGCTGTCTGCGTGGGTCA
GCGGCCGCGCATCTGGATTGCCTTT 185
21 GMPS-3′-UTR-F
GMPS-3′-UTR-R CTCGAGGCTACATCCCACCTGAC
GCGGCCGCTTAACAACCGGAACACG 190
22 BTAF1-3′-UTR-F
BTAF1-3′-UTR-R CTCGAGGGTTTGTAGCTTGCTGTGTG
GCGGCCGCGTATTCCCAGTTTTATTTTC 201
23 AMOTL1-3′-UTR-F
AMOTL1-3′-UTR-R CTCGAGTTTTGGGAAATGGT
GCTGCGGCCGCGGAAATCTTTGGCTGAC 207
24 DAZAP1-3′-UTR-F
DAZAP1-3′-UTR-R CTCGAGTTACCTGGTGGGATAGA
GCGGCCGCCTAAACCTTTTGCCTGA 178
25 NOL8-3′-UTR-F
NOL8-3′-UTR-R CTCGAGTATGGCTTAAATGTGAC
GCGGCCGCTCATAAACTTCTGGTAAACA 244
26 LOC776816-3′-UTR-F
LOC776816-3′-UTR-R CTCGAGTCGCATCCGAGCCTTAC
GCGGCCGCTTCCCAATTTGGTTTCCTA 235
27 IGF2R-3′-UTR-F
IGF2R-3′-UTR-R CTCGAGCAGTTTGTCAGCATGGGGAA
GCGGCCGCCATTGCCCATAAATTAAAGA 251
28 RAB3GAP1-3′-UT
R-FRAB3GAP1-3′-UTR-R CTCGAGACTAACTCCGTTGAATA
GCGGCCGCGTAGGTTTAGATTTATTG 166
29 DDX3X-3′-UTR-F
DDX3X-3′-UTR-R CTCGAGCACCGTATGCGTGAAATTAT
GCGGCCGCGTGTATCAAAACCTTGGCAT 174
30 PRICKLE1-mut-3′-UTR-F
PRICKLE1-mut-3′-UTR-R TCGAGTACGATATCGAACTAGATTTGTTAGGGGTTT-
AACAGCCAGCAGTGGGATGAAATAGTGC
TTGTAGCGGCCGCTACAAGCACTATTTCATCCCACTGCTGGC-
TGTTAAACCCCTAACAAATCTAGTTCGATATCGTAC 75
31 COLA-mut-3′-UTR-F
COLA-mut-3′-UTR-R TCGAGATGCCTCTCAGAACATCACCTACCACTGCAA-
GAACCTGCAGTGCTACATGGATGAGGAGACTGGGC
GGCCGCCCAGTCTCCTCATCCATGTAGCACTGCAG-
GTTCTTGCAGTGGTAGGTGATGTTCTGAGAGGCATC 75
32 BCAT1-mut-3′-UTR-F
BCAT1-mut-3′-UTR-R TCGAGGTTTTGTAGAAGCACAATTAAACACTCCTA-
ACCAGCAGTGTACATACAGACCATCTGGCATGC
GGCCGCATGCCAGATGGTCTGTATGTACACTGCT-
GGTTAGGAGTGTTTAATTGTGCTTCTACAAAACC 72
33 ANTXR1-mut-3′-UTR-F
ANTXR1-mut-3′-UTR-R TCGAGAACAGGTTGGAAAAGAGATTGGTTTTCAGC-
ATTACCAGCAGTGGGGTTTTTTTTAGTGTCAATTGC
GGCCGCAATTGACACTAAAAAAAACCCCACTGCTGG-
TAATGCTGAAAACCAATCTCTTTTCCAACCTGTTC 75
34 TECPR1-mut-3′-UTR-F
TECPR1-mut-3′-UTR-R TCGAGTACTCGGTGTGCTCCTCCGTGTGAATTCCTT-
TGCCAGCAGTGGTATTCACAGCTGGTACATATTCCGC
GGCCGCGGAATATGTACCAGCTGTGAATACCACTGCT-
GGCAAAGGAATTCACACGGAGGAGCACACCGAGTAC 75
35 TBC1D9B-mut-3′-UTR-F
TBC1D9B-mut-3′-UTR-R TCGAGAAAATCCAGGAAGAAAACTCTCTGATTCCA-
CTGCTAGCAGTGAAAAAGAAAAGATTTCAGTCCGC
GGCCGCGGACTGAAATCTTTTCTTTTTCACTGCTA-
GCAGTGGAATCAGAGAGTTTTCTTCCTGGATTTTC 77
36 NT5C3A-mut-3′-UTR-F
NT5C3A-mut-3′-UTR-R TCGAGAAAATCCAGGAAGAAAACTCTCTGATTCCA-
CTGCTAGCAGTGAAAAAGAAAAGATTTCAGTCCGC
GGCCGCGGACTGAAATCTTTTCTTTTTCACTGCTA-
GCAGTGGAATCAGAGAGTTTTCTTCCTGGATTTTC 74

表 1 用于扩增或合成候选靶基因3′-UTR的引物 Table 1 Primers used for amplifying the wild type or mutated 3′-UTRs of putative mRNA targets

1.4 候选靶基因文库的构建