一种RNA反转录扩增方法与流程

作者：张馨予

一种RNA反转录扩增方法与流程

本发明涉及核酸扩增领域，具体涉及核糖核酸(rna)的反转录扩增方法。

背景技术：

作为遗传信息的载体，dna和rna是生命科学研究的重要对象。而从生物体内直接获得的dna和rna往往因载量不够，需要通过体外扩增进行富集。目前，主要的体外扩增dna的方法包括聚合酶链式反应(pcr)，等温扩增技术(如hda、sda、rpa、expar、lamp、nasba、rca等)等。此类技术多以dna作为直接的扩增模板。

rna的体外扩增，往往需要先以rna为模板，通过反转录酶合成cdna，再以cdna为模板进行扩增。和dna扩增体系相比，rna扩增体系有三个不同点：以rna而非dna为模板；体系中需添加反转录酶；pcr扩增之前，需要额外的反转录程序。因此，反转录的效率主要受上述3个因素的影响。

(1)rna模板对反转录的影响：a.纯度：高质量的rna是高反转录效率的前提，可以增加cdna合成的长度和产量。一方面，需尽可能去除样品及提取试剂中有可能会抑制反转录酶及聚合酶活性的物质，如裂解液；另一方面，需尽可能维持rna的完整性，避免rna断裂或降解，如在提取时加入rnase抑制剂。b.结构：rna本身的二级结构会影响引物与之结合的效率，并进而影响反转录效率。因此，适当提高反转录温度、或在体系中加入适量的dmso或甘油等，均对打开rna的二级结构有辅助作用，从而提高反转录效率。

(2)酶对反转录的影响：a.反转录酶的种类：最常用的反转录酶包括鼠白血病逆转录酶(mmlv)和禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(amv)。mmlv的最适反应温度为37℃，其合成cdna的长度范围大致为100-500个核苷酸。amv的最适反应温度为42-55℃，最高可达60℃，因此，如果rna结构比较复杂时，应用可耐受更高温的amv进行反转录的效果要优于mmlv，此外，其体外合成cdna的长度范围也优于mmlv。但是，上述两种酶除具有以rna为模板，催化dntp聚合成cdna的dna聚合酶活性外，还具有rnaseh活性；通常来说amv要比mmlvrnaseh的活性高一些。rnaseh活性会同反转录酶的聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，因而会降低cdna合成的产量和长度，因此，目前所用的大多数商品化的反转录酶会通过突变或删除等方式降低或去除其rnaseh的活性。此外，研究人员还会通过基因工程的改造，提高反转录酶的耐热性和cdna合成速度，从而提高反转录的效率。b.反转录酶的用量：在反转录时间一定时，反转录酶浓度偏低可能导致cdna合成速率降低，因此，适当提高反转录酶浓度可以提高单位时间内cdna的合成速率，并在一定程度上弥补反转录时间不足的缺陷。

(3)程序对反转录的影响：根据cdna合成过程与dna扩增过程是否在同一缓冲液及酶中进行，以rna为模板的扩增可分为两步法和一步法。

两步法是在反应管内先进行以rna为模板的cdna合成，再取出少量该管内的产物作为模板，进行第二步聚合酶链式反应。其优点是：反转录与扩增在不同的反应管中进行，可分别进行条件优化。缺点是：操作复杂，开管取样易造成污染；仅有部分合成的cdna作为模板参与第二轮扩增。

一步法中，cdna的合成及以cdna为模板的扩增是在同一反应管中进行的。其优点是：①反转录及扩增过程无需更换反应管，操作简单，还可避免因开管而造成的污染；②反转录合成的所有cdna均可作为pcr扩增的起始模板。一步法在刚出现的时候并不受欢迎，这是因为其体系优化较两步法要复杂。具体而言，一步法中所有的反应组分均在同一反应管内，该反应管内的缓冲条件、离子强度等，既要满足反转录的需求，还要满足后续扩增的要求。针对该问题，市场上已有多种商品化的一步法rt-pcr试剂预混液，既能保障反转录的效率，又能确保后续的高效扩增，研究人员仅需将适量的模板、引物及水加入预混液中即可完成反应液的配制。因此，一步法rt-pcr，特别是在诊断领域，得到了越来越广泛的认可及应用。

虽然一步法相对两步法来说，在操作步骤、及避免开管移样造成污染上均有所改进，但仍需要一个不同于后续扩增的温度控制程序。这对核酸的快速检测，特别是通过恒温方法进行扩增(如等温扩增、对流pcr)的方法来说，会使得其在进行以rna为模板的扩增时，无法实现从反应起始到结束的全程恒温。那么，原本十分简易的恒温扩增装置，则不得不引入程序控制模组、及要求更高的温控模组。这无疑会在一定程度上增加仪器的重量、成本及操作复杂度；并且降低了应用恒温方法进行扩增的优势。

技术实现要素：