经验分享：AAV载体介导血友病基因治疗的研究进

作者：张馨予

经验分享：AAV载体介导血友病基因治疗的研究进展与挑战

2022-03-09 01:00 来源: 基因狐

原标题：经验分享：AAV载体介导血友病基因治疗的研究进展与挑战

腺相关病毒（AAV）介导的血友病基因治疗经临床试验证明了其有效性。然而， FDA 拒绝了 BioMarin Pharmaceutical 提交的首个血友病基因治疗产品的生物制剂许可申请，虽然结果令许多人感到惊讶，但说明了对于实现血友病AAV基因治疗潜力至关重要的突出问题仍然存在。本文将带大家了解一下AAV载体在血友病基因治疗中的研究进展与挑战。

1.血友病的常规治疗方法

血友病 A 和 B 是分别由因子 (F) VIII 和 IX 蛋白缺失或功能障碍引起的 X 连锁隐性疾病。出血是血友病的主要症状，尤其是关节或肌肉出血。流行病学调查显示，每 100,000 名男性患血友病 A 和 B约为 17.1和 3.8。

血友病主要使用凝血因子 VIII (FVIII) 或 IX (FIX) 浓缩物作为替代疗法进行治疗。因子替代疗法旨在减少复发性出血引起的使人衰弱的肌肉骨骼并发症，延长预期寿命，并促进就业和独立生活；然而，并没有消除患关节病的风险。此外，因子替代疗法存在较大的局限性，包括定期输注的负担、成本负担、抑制性抗体以及在许多国家的可用性有限等。

Emicizumab (Hemlibra®)，这是一种针对 FIXa 和 FX 的人源化单克隆双特异性抗体，通过桥接激活因子(F) IX和FX来恢复A型血友病的FVIII激活功能缺陷。使用 Emicizumab 进行有效预防需要坚持定期注射，而出血保护可能不完整，患者仍有因重大创伤和手术而出血的风险。

2.血友病基因治疗的基本原理

如血友病的一类单基因遗传病，是由于单个基因变异导致功能性蛋白质不表达或表达为非功能性蛋白质而引起的疾病，基因治疗则提供致病基因的功能性拷贝，从而有效地治疗该疾病。基因治疗最初的障碍是治疗基因低效递送至靶细胞，通过采用源自哺乳动物病毒的病毒载体可将其遗传物质递送到细胞和组织中这一自然特性，成功解决了治疗基因递送问题。这些载体通常包含最少的野生型病毒序列，并且它们的致病基因、复制基因和结构病毒基因被治疗基因盒替换。多年来，在血友病基因治疗中，使用腺相关病毒 (AAV) 载体进行的肝脏体内基因转移在临床前和临床研究中取得了极大的成功。

血友病非常适合通过基因治疗进行纠正，因为出血表型对广泛的因子水平有反应，不需要精确的调节。此外，由于凝血因子蛋白被分泌到循环中，将基因传递到部分肝细胞即可纠正出血因素。FVIII 和 FIX 可以在非天然细胞和组织中合成。例如，尽管 FVIII 是由肝血窦内皮细胞（LSEC）和肝外内皮细胞等特殊内皮细胞自然分泌的，但在肝细胞中的表达产生的功能性蛋白质已证实能在动物模型和人类患者中恢复止血。最后，对于因因子供应不足而导致合并症和死亡的发展中国家患者，基因治疗可以通过单次治疗而持续提供凝血因子。

3.AAV载体

AAV 载体源自野生型 AAV，是细小病毒家族的成员。野生型 AAV 无致病性、免疫原性弱、复制缺陷，需要辅助病毒进行复制。AAV 载体可以将长达 5 kb 的治疗性转基因盒传递到分裂和非分裂细胞中。AAV 血清型根据病毒衣壳同源性分为进化枝，病毒衣壳控制组织嗜性和细胞内病毒颗粒运输。通过随机和定向诱变以及衣壳基因改组产生的工程化 AAV 衣壳被不断开发以增强人类肝细胞的趋向性，抵抗中和抗体，并避免细胞毒性 T 细胞对转导肝细胞的载体消除。表达盒的工程化也是基因治疗成功的关键。例如，可以通过设计更强的肝脏特异性启动子、F8 和 F9 cDNA的密码子优化，以及使用工程化 F8（B 域缺失的 FVIII 变体）和 F9（过度活跃的 FIX-Padua 变体 R338L）来增强载体效力。一些临床试验使用消除了免疫刺激性 CpG 基序的表达盒。然而，由于病毒基因组的反向末端重复序列也包含 CpG 基序，因此不可能从载体中完全消除它们。此外，研究表明血友病动物模型中的 AAV 载体肝脏导向基因治疗通过诱导因子特异性的调节性 T 细胞 (Treg) 诱导对 FVIII 和 FIX 的免疫耐受。例如，AAV-F8 和 AAV-F9 载体肝基因转移是犬血友病模型中的有效诱导免疫耐受。尽管这些结果令人鼓舞，但对人体是否引起相同效应仍需得到证实。