第2周：RNA-seq数据分析最佳实践

作者：杨超月

1. 摘要

RNA测序（RNA-seq）具备普遍的应用，但没有统一的分析流程能适用于全部状况。咱们回顾了RNA-seq数据分析的全部主要步骤，包括实验设计，质量控制，序列比对，基因和转录水平的定量，可视化，差别基因表达，可变性剪接，功能注释，基因融合检测和eQTL定位。数据库

2. 背景

RNA-seq的强大之处在于既能发现（好比新的转录本）又能定量（好比基因的差别表达）；

实验设计和分析流程须要具体状况具体分析；

每一个RNA-seq实验方案均可能具备不一样的最佳方法用于转录本定量，标准化和最终的差别表达分析。

图1 RNA-seq信息分析的通用路线图。主要分析步骤列在预分析，核心分析和高级分析的上方。a预处理包括实验设计，测序设计和质量控制步骤。 b核心分析包括转录组分析，差别基因表达和功能分析。 c高级分析包括可视化，其余RNA-seq技术和数据整合。缩写：ChIP-seq染色质免疫沉淀测序，eQTL表达数量性状基因座，FPKM等于Fragments / (外显子长度*Mapped Reads)，GSEA基因富集分析，PCA主成分分析，RPKM等于total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))，sQTL剪接数量性状基因座，TF转录因子，TPM每百万转录本。浏览器

3. 实验设计

文库类型：单端、双端，insert size

读长：二代、三代

测序深度（测序量）：取决于研究的转录本的复杂性，并非越多越好

生物学重复：3个以上吧（取决于实验设计）

RNA提取：真核生物能够利用poly（A）针对性选择以及rRNA降解的方式来富集mRNA；原核生物只能利用后者

较便宜的短SE reads一般足以用于研究注释良好的物种中的基因表达水平，而较长和PE reads优先用于研究缺少注释的转录组。app

饱和曲线（Saturation curves）：评估在给定测序深度下预期的转录组覆盖度工具

对测序实验进行适当规划以免技术误差与良好的实验设计一样重要，特别是当实验涉及须要分批处理的大量样品时。性能

4. RNA-seq数据分析 4.1 质量控制 4.1.1 Raw reads

涉及测序质量，GC含量，adaptor，不合适的k-mers和PCR重复的分析，进而检测是否存在测序错误，PCR人为偏差或污染。
工具：FastQC、NGSQC、FASTX-Toolkit、Trimmomatic学习

4.1.2 Read alignment

比对率：the percentage of mapped reads，总体测序准确性和污染DNA存在的全局指标
原文此处举了一个例子，须要理解一下：测试

RNA-seq reads比对到人类基因组上，比对率指望是70％到90％，同时因为序列的类似性，一条reads能够同时比对到多个位置，所以存在多比对reads。
可是当reads比对到转录组时，比对率会小一些，由于落在未注释的转录本区域（存在可是暂时尚未发现的那些）的reads会被咱们忽略。同时，因为存在一个基因有不止一个转录本，且不一样的转录本共享外显子区域（常见）的状况，故一个reads能够比对到多个转录本上（常见），因此多比对reads明显增多。编码

覆盖度的均一性：不一样的外显子上，正负链上翻译

poly（A）针对性选择富集mRNA以后，若是reads主要集中在转录本的3'末端，可能代表起始材料中的RNA质量低。

比对上的reads的GC含量能够用来揭示PCR偏向性。我是这样理解的，下图就是一个例子，不一样的GC含量对应的测序深度不同，极可能就是因为GC含量的差别引发了PCR的偏向。

工具：Picard、RSeQC、Qualimap

4.1.3 Quantification

一旦计算出实际的转录本定量值，就应检查它们的GC含量和基因长度误差，以便在必要时能够应用校订标准化方法。
若是参考转录组被很好地注释，还能够分析样品的RNA组成，以此来评估RNA纯化的质量。

工具：R包（NOISeq、EDASeq等）

4.1.4 Reproducibility（可再现性）

经过检查重复之间的可再现性和可能的批次效应来评估RNA-seq数据集的全局质量也是相当重要的。
若是基因表达差别存在于不一样的实验条件之间，则应该能够预知相同条件的生物学重复将在主成分分析（PCA）中汇集在一块儿。

4.2 转录本鉴定