Science深度综述：CR无油真空泵ISPR/Cas指引基因工程的未来
近日，顶尖学术期刊《科学》推出了“变革生物学的技术”特刊，为我们详细介绍了数种目前正在给生物学领域带来革新的重磅技术。在今天的这篇文章里，药明康德微信团队为各位读者朋友们整理了其中关于CRISPR/Cas的内容，一道展望它能如何指引基因工程的未来。
CRISPR-Cas基因编辑系统的多样性、模块性和高效性正在掀起一场生物技术革命。RNA指导的Cas酶已经被用来作为在培养细胞，动物和植物中操纵基因组的工具。它不但加快了基础研究的步伐，而且让临床和农业突破成为可能。日前，CRISPR-Cas基因编辑系统的鼻祖之一，加州大学伯克利分校的Jennifer A. Dounda博士和她课题组的Gavin J. Knott博士在《科学》杂志上撰文，对这一技术的优势、进化趋势和应用进行了盘点。
Jennifer A. Dounda博士（图片来源：加州大学伯克利官网）
从微生物的免疫系统到可编程的基因组编辑工具
CRISPR-Cas系统是微生物体内的一种RNA指导的适应性免疫系统。它利用RNA来引导核酸酶与特定核酸序列相结合并且将它们切断。当病毒入侵细菌时，细菌能够捕捉到外来遗传物质的片段并且将它们整合到自身基因组中的CRISPR序列中。CRISPR序列转录生成的CRISPR RNA（crRNA）能够与Cas核酸酶相结合，通过与靶点核酸序列进行碱基配对为Cas核酸酶提供结合特异性。Cas核酸酶和crRNA结合之后，能够在细菌体内起到监控病毒入侵的作用，当与crRNA匹配的遗传片段再度出现时，Cas核酸酶能够切断这些遗传片段，从而提供免疫保护作用。
CRISPR-Cas适应性免疫系统（图片来源：《科学》）
在众多天然CRISPR-Cas系统中，2类（class 2）系统只需要一个RNA指导的Cas核酸酶就能够完成对靶点的切割。其中Cas9核酸酶成为了第一个被用于基因组编辑的Cas效应子。Cas9有诸多特点让它能够进行准确而有效的编辑。Cas9通过特异性识别crRNA和它与反式激活crRNA（tracrRNA）之间的相互作用保证Cas9只和对应的指导RNA相结合。而crRNA和tracrRNA可以被融合成一个指导RNA（sgRNA）。最后，Cas9需要与特定PAM序列旁边的DNA片段相结合才能触发Cas9的双链DNA切割功能。世界各地的科学家们选择Cas9作为基因编辑工具的原因正是因为这种核酸酶的可控性和通过修改sgRNA靶点就能改变Cas9切割位点的便捷性。
虽然Cas9仍然是最常用的Cas效应子，但是科学家们已经将Cas效应子的范围扩展到其它类型的Cas蛋白中去。CRISPR-Cas12a能够靶向DNA序列，而CRISPR-Cas13a能够靶向RNA。这些由RNA指导的核酸酶系统的可编程（programmability）特点是CRISPR-Cas系统能够在精准基因组编辑以外获得广泛应用的关键。
2类CRISPR-Cas系统（图片来源：《科学》）
Cas媒介的基因组编辑的应用
虽然Cas的应用范围已经得到扩展，但是精准基因组编辑仍然是CRISPR革命的前沿。Cas9和Cas12a能够在特定位点触发双链DNA断裂，在细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）对双链DNA断裂进行修复后基因组编辑就会发生。
作为精准基因组编辑工具，Cas9和Cas12a能够在多种细胞种类和生物中起作用。它们可以用于全基因组筛选来研究基础生物功能，或者发现和验证复杂遗传病的潜在药物靶点。在临床试验中，Cas核酸酶可以治疗由已知遗传因素导致的疾病，例如在杜氏肌营养不良症（DMD）中，使用基因编辑可以修正基因突变或者诱发转录过程跳过有缺陷的外显子。Cas9可以用于让导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）等神经疾病的致病基因失活。除了对体细胞进行基因编辑，这一系统还有在人类胚胎中修正基因突变的潜力，从而在人类生殖细胞中产生可遗传的变化。
然而，值得注意的是精准编辑仍然是一个挑战，因为NHEJ导致的修复结果可能与期待的HDR导致的修复结果竞争。另一种策略是将Cas效应子与碱基编辑器（base editor）融合在一起。这可以限制不想要的编辑并且消除修复模板的需求。与切割DNA然后进行修复不同，切口酶Cas9（nCas9）媒介的碱基编辑将单碱基编辑器携带到指定靶点，并且在促进碱基变换的同时不产生双链DNA切割。如今Cas9媒介的单碱基编辑器让研究人员能够在特定基因组位点生成任意一种碱基变换结果。展望未来，下一代的Cas媒介的基因组编辑器很可能包括碱基编辑器，它们的碱基编辑活性可能通过构象变化，与Cas9媒介的靶点DNA结合偶联在一起。
CRISPR-Cas系统的各种应用（图片来源：《科学》）
使用dCas9调控转录过程
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