大肠杆菌连猪仔都会得？出自：扬州大学动物科

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　大肠杆菌 F18 诱发的腹泻是仔猪最常见的肠道炎症疾病之一，可导致严重的经济损失。然而，大肠杆菌 F18 感染易感性的分子机制尚不清楚。

　　近日，江苏省现代农业（生猪）技术体系良种繁育岗位专家、扬州大学动物科学与技术学院包文斌教授为通讯作者，在国际病原学权威期刊PLoS Pathogens(IF: 6.823) 发表了题为“Insight into mechanisms of pig lncRNA FUT3-AS1 regulating F18-bacterial diarrhea”的研究论文，首次系统解析了 lncRNA 调控仔猪细菌性腹泻抗性的分子机制。

　　研究结果

　　1、猪 FUT3-AS1 是与易感性相关的宿主调节因子

　　为了研究宿主 lncRNA 在断奶仔猪 F18 感染中的作用，对中国地方猪品种梅山猪和培育品种苏太猪 F18 抗性仔猪和敏感仔猪十二指肠组织，分别进行了全转录组测序。结果显示，共有 3 个 lncRNA 同时在 2 个猪种的 F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达（图 A）。其中 FUT3-AS1 (TCONS_00183659) 是位于 FUT3 基因反义链的一个 lncRNA（图 B）。已有研究表明 FUT3 基因与F18 受体的产生有关，且全转录组测序结果显示 FUT3 在 F18 抗性和敏感仔猪中也存在差异表达。

　　RT-PCR、Northern blot 证实 FUT3-AS1 在 F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达（图 C-D）。

　　图1｜猪 FUT3-AS1 是与易感性相关的宿主调节因子

　　2、下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对的抗性

　　进一步研究显示， F18 刺激可以引起猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 中 FUT3-AS1 的表达显著上调（图 A）。在 IPEC-J2 细胞中敲降 FUT3-AS1，粘附在细胞上的细菌数量显著降低（图 D-H）。这些结果表明 FUT3-AS1 在调节 18 感染中发挥作用，并且其表达的下调增强了 IPEC-J2 细胞对 18 的抗性。

　　图2｜下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对的耐药性

　　3、细胞核中 FUT3-AS1 的作用机制

　　RNA-FISH 和核质分离实验显示 FUT3-AS1 在细胞核和细胞质中均有分布（图 1 E-F），接下来分别研究它在细胞核和细胞质中的作用机制。

　　qRT-PCR 和 western blot 显示，FUT3-AS1 敲除后细胞中 FUT3 表达显著降低（图 A）。RNA pull-down 鉴定到 19 个与 FUT3-AS1 结合的蛋白质，其中包含组蛋白 H4。RIP-qPCR 显示组蛋白 H4 可以特异性结合 FUT3-AS1（图 E-F）。ChIP、DNA pull-down 结果显示，组蛋白 H4 可以直接结合到 FUT3 核心启动子区域（图 G-H）。

　　图3｜FUT3-AS1 通过影响 FUT3 启动子组蛋白 H4K15ac 水平调控 FUT3 转录

　　使用组蛋白去乙酰化抑制剂处理 IPEC-J2 细胞，可以显著促进 FUT3 的表达，但并不影响 FUT3-AS1 的表达（图 I-J）。ChIP-qPCR 显示，siFUT3-AS1 细胞中 FUT3 核心启动子区域中 H4K15ac 乙酰化水平显著降低（图 L）。

　　Alibaba 和 JASPAR 软件预测显示有多个转录因子可以结合到 FUT3 启动子区域。双荧光素酶报告实验表明，转录因子 Sp1 的转录结合活性在 siFUT3-AS1 细胞中表现出显著下降、在组蛋白去乙酰化抑制剂 TSA 处理的细胞中显著增强（图 M）。

　　以上结果表明，FUT3-AS1 可能通过介导 FUT3 核心启动子上的 H4K16ac 水平和 Sp1 结合活性来促进 FUT3 的表达。

　　4、细胞质中 FUT3-AS1 的作用机制

　　Small RNA 测序显示在抗性和敏感仔猪中有 32 个 miRNA 存在差异表达（图 A），并构建了 ceRNA 调控网络（图 B），其中 miR-212 在 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 中都有结合位点。

　　IPEC-J2 细胞中上调 miR-212 可以显著降低 FUT3 的表达，而下调 miR-212 可以显著促进 FUT3 的表达（图 C-D）。siFUT3-AS1 细胞中 miR-212 表达显著上调（图 E）。荧光素酶报告和 Ago2 抗体的 RIP 实验证实 miR-212 可以直接与 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 结合（图 G-J）。miR-212 inhibitor 可以显著增加细胞上粘附的细菌数量（图 K-L），但同时敲降 FUT3-AS1 时细菌粘附降低。

　　以上结果，FUT3-AS1 可作为 miR-212 的分子海绵，促进 FUT3 的表达以增强F18 的敏感性。

　　图4｜FUT3-AS1 作为分子海绵吸附 miR-212 并靶向调节 FUT3

　　5、FUT3 是防治细菌性腹泻的潜在靶点