具有热稳定性的新冠病毒刺突蛋白S三聚体

作者：张馨予

　　新冠肺炎（COVID-19）在全球确诊的人数已突破2000万，目前全球范围内的感染人数还在持续攀升，近月来我国境内也有小范围的爆发，对公共健康造成了极大的威胁，对经济发展造成了严重影响。目前针对新冠病毒有多种特效药和疫苗正在研发中，但其效果还有待验证。对新冠病毒（SARS-CoV-2）的基础与应用研究是开发有效的抗病毒药物和疫苗的关键。

　　近日，英国医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-Laboratory of Molecular Biology）熊晓犁，曲昆团队和中山大学附属第七医院（深圳）的张影团队合作，在剑桥大学病毒学系、治疗免疫学与感染疾病研究所以及多家剑桥当地医院的倾力合作下，在Nature Structure & Molecular Biology杂志上发表了题为“A thermostable, closed SARS-CoV-2 spike protein trimer”的研究论文，报道了他们在新冠病毒刺突蛋白结构生物学的研究基础上开发出了具有热稳定性的刺突蛋白三聚体。

具有热稳定性的新冠病毒刺突蛋白S三聚体

　　新冠病毒的刺突蛋白（Spike Protein）位于病毒表面，介导病毒与受体ACE2的结合，从而帮助病毒感染细胞并产生新的病毒颗粒。该蛋白也是免疫系统识别的主要目标，是疫苗和抗体药物研发的关键靶点。由于病毒的表面抗原蛋白的不稳定性，以至于多种病毒疾病如艾滋病毒（HIV），呼吸道合胞病毒（RSV）等至今仍没有有效的疫苗。因此，开发稳定的抗原对研发有效的新冠病毒疫苗有着重要的意义。一系列的研究发现冠状病毒，特别是SARS冠状病毒家族的刺突蛋白具有多种构象，其受体结合域（Receptor Binding Domain， RBD）具有相当的结构动态可以保持关闭和打开两种状态。熊晓犁研究员在研究2002年爆发的SARS-CoV-1刺突蛋白的过程中，发现刺突蛋白的受体结合域的结构动态可能与其结构的不稳定性有关（Alexandra C. Walls#， Xiaoli Xiong# et al. Unexpected Receptor Functional Mimicry Elucidates Activation of Coronavirus Fusion. Cell, 2019, doi:10.1016/j.cell.2018.12.028. ）。为了解决新冠病毒刺突蛋白的不稳定性，他们设计了二硫键将刺突蛋白的受体结合域与S2交联，将刺突蛋白固定在关闭状态以希望增强其结构稳定性。同时，熊晓犁参与研究的另外一项研究“Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions”近日刚在Nature发表（）。

　　根据新冠病毒刺突蛋白的电镜结构，研究人员设计了两对二硫键（x1，x2）使刺突蛋白的RBD与S2部分发生交联。Western Blot 和蛋白提纯胶带显示x1和x2都可以让刺突蛋白发生交联，形成3聚体，该交联在有还原剂的条件下消失，说明设计的二硫键发挥了交联作用。蛋白提纯实验发现x1的交联不完全而x2能获得完全交联的刺突蛋白（图1）。

具有热稳定性的新冠病毒刺突蛋白S三聚体

　　图1 设计的二硫键（x1，x2）在刺突蛋白结构中的位置和其表达与提纯结果。

　　通过电镜观察负染的蛋白样品研究人员发现>90%未经交联的蛋白在4℃保存3天后，或在60℃加热30分钟后会解聚变性。二硫键交联的x1, x2蛋白则至少能在4℃保存30天不变性。x1,x2蛋白也可以在60℃加热30分钟后维持其3聚体结构（图 2）。

具有热稳定性的新冠病毒刺突蛋白S三聚体

　　图2 二硫键（x1，x2）交联的刺突蛋白能长期4℃保存并具有热稳定性。

　　通过冷冻电镜的数据收集与分析，研究人员发现x1，x2交联的刺突蛋白颗粒全部都保持关闭的状态，在电镜密度图中可以观察到设计的x1，x2二硫键的密度。在结构解析的过程中他们发现x2刺突蛋白的结构与以前解析的新冠病毒刺突蛋白在关闭状态（closed）时的结构相似，x1刺突蛋白却具有关闭（closed）和锁定（locked）两种不同的构象。其中锁定的构象是首次被观查到。在这种构象的结构中，位于融合肽附近的833-855氨基酸折叠形成了一种特殊的构型，该构型区域位于RBD的下方，在关闭 (closed)状态下并不能观察到。这段区域的多肽构型像一个门楔子一样使RBD保持着更为紧密的锁定 (locked)状态。据推断，该锁定构象结构可能是捕捉到的新冠病毒感染过程中刺突蛋白的一个中间状态（图3）。

具有热稳定性的新冠病毒刺突蛋白S三聚体

　　图3 x1，x2刺突蛋白的冷冻电镜结构。