Science全文编译！我国科学家从结构上揭示一种强效的治疗性抗体中和SARS-CoV-2和SARS-CoV机制
2020年7月26日讯/生物谷BIOON/---据世界卫生组织（WHO）统计，截至2020年6月8日，2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行已导致200多个国家/地区的700多万感染，并造成40万人死亡。导致这次大流行的病原体是一种新出现的冠状病毒：SARS-CoV-2，它与密切相关的SARS-CoV同属于冠状病毒科β冠状病毒属B谱系。位于SARS-CoV-2和SARS-CoV包膜的刺突糖蛋白（S）具有大约80%的氨基酸序列一致性，而且这两种病毒均利用人血管紧张素转化酶2（hACE2）进入宿主细胞。细胞进入是通过S蛋白同源三聚体介导的病毒-受体结合实现的，然后是病毒-宿主膜融合，其中这种结合是通过S蛋白的受体结合结构域（RBD）进行的。破坏S蛋白在感染建立中所发挥的这一关键作用是中和抗体的主要目标，也是治疗性干预和疫苗设计的重点。
之前表征的几种SARS-CoV中和抗体（NAb）被证明对SARS-CoV-2的中和活性非常有限。在这些中和抗体中，CR3022是一种针对SARS-CoV的弱中和抗体，虽然可以紧密结合SARS-CoV-2，但对后者无中和作用，这表明中和表位可能存在构象差异。近期的研究报道了两种SARS-CoV中和抗体47D11和S309也被发现可以中和SARS-CoV-2，这提示着β冠状病毒属B谱系内存在广泛的交叉中和表位。含有SARS-CoV-2中和抗体的恢复期血浆已被发现可以为COVID-19患者提供明确的保护，然而科学家们对SARS-CoV-2的免疫原性特征和关键表位的了解还存在差距，这阻碍了为这种病毒开发有效的免疫疗法。
SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD具有大约75%的氨基酸序列一致性，因此有可能发现靶向RBD的交叉中和抗体。在一项新的研究中，来自中国科学院、中国科学院大学、中国军事医学科学院、中国食品药品检定研究院、中国医学科学院、北京协和医学院、北京神州细胞生物技术公司和北京义翘神州科技公司的研究人员通过使用噬菌体展示技术，构建出一个抗体库，该抗体库是从由用重组SARS-CoV RBD免疫的小鼠的外周淋巴细胞中提取的RNA产生的。利用SARS-CoV-2 RBD作为筛选噬菌体抗体库的靶点，寻找潜在的命中目标。将显示与SARS-CoV-2 RBD紧密结合的抗体作为嵌合抗体进行进一步优化，并使用基于水泡性口炎病毒（VSV）的假型病毒系统测试它们的中和活性。相关研究结果于2020年7月23日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody”。
在测试的抗体中，对SARS-CoV-2假病毒具有强效中和活性的抗体克隆014进行人源化，并将它命名为H014。为了评估结合亲和力，利用OCTET系统监测H014与SARS-CoV-2 RBD或SARS-CoV RBD的实时结合和解离。H014 IgG和它的Fab片段均表现出与SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD的紧密结合，与这两种RBD在亚nM水平上具有相当的结合亲和力（图1A）。
图1.H014是一种具有治疗价值的B谱系冠状病毒交叉中和抗体，图片来自Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881。
假病毒中和试验显示H014具有强效的中和活性：对SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒的50%中和浓度值（IC50）分别为3 nM和1 nM（图1B）。对真正的SARS-CoV-2毒株（BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020）进行的斑块还原中和试验（plaque-reduction neutralization test, PRNT）验证了它的中和活性：它的IC50为38 nM，比在假型病毒系统中观察到的低10倍（图1C）。这些作者接下来试图评估H014在他们先前建立的hACE2人源化小鼠模型中的体内保护功效，其中这种小鼠模型对SARS-CoV-2感染敏感。
在这种小鼠模型中，由于hACE2在肺细胞表面上的表达，SARS-CoV-2进入肺部，并像在人体中一样复制，在感染5天后表现出肺部病变。hACE2人源化小鼠在5×105 PFU的SARS-CoV-2（BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020）鼻内感染4小时后（1剂，治疗）或12小时前和4小时后（2剂，预防加治疗），腹腔注射50mg/kg的H014进行治疗。所有遭受病毒挑战的小鼠在第5天时被杀死。虽然PBS组（对照组）小鼠肺部的病毒载量在第5天飙升至约107 RNA拷贝/g（图1D），但是值得注意的是，在预防组和预防加治疗组小鼠中，H014治疗使得它们的肺部的病毒滴度在第5天分别降低了大约10倍和100倍（图1D）。肺部病理分析显示，SARS-CoV-2在磷酸盐缓冲液（PBS）处理后引起轻度间质性肺炎，其特点是炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚和明显的血管系统损伤。相比之下，在接受H014治疗的小鼠的肺切片上未观察到明显的肺泡上皮细胞病变或局灶性出血（图1E），这表明H014在治疗COVID-19方面具有潜在的治疗作用。
SARS-CoV-2 S蛋白三聚体的整体结构与SARS-CoV和其他冠状病毒相似。S蛋白的每个单体由两个功能性亚基组成。S1亚基结合宿主细胞受体，而S2亚基介导病毒膜与宿主细胞膜的融合。S1亚基内的四个结构域包括N端结构域（NTD）、RBD和两个亚结构域（SD1和SD2），这两个亚结构域的位置与S1/S2的切割位点相邻。RBD的铰链样运动产生了两种不同的构象状态，称为“关闭”和“开放”，其中关闭状态对应于受体不可访问状态，开放状态对应于受体可访问的状态，这应该是是亚稳定的。
对稳定化的SARS-CoV-2 S蛋白的胞外结构域与H014 Fab片段形成的复合物的低温电镜（Cryo-EM）结构表征发现，这种复合物采用三种不同的构象状态，分别对应一个RBD开放+两个RBD关闭（状态1）、两个RBD开放+一个RBD关闭（状态2）和三个RBD全部开放（状态3）（图2A）。有趣的是，尽管存在过多的Fab，但是完全关闭（状态4）的SARS-CoV-2 S蛋白三聚体在没有任何Fab结合下的结构也在Cryo-EM数据的三维分类过程中观察到，这提示着H014的结合位点通过蛋白“呼吸”暴露，随后进行随机RBD运动（图2A）。这些作者在3.4～3.6 埃米的分辨率下对这4种状态的S蛋白进行不对称cryo-EM重建。然而，由于构象的异质性，RBD和H014之间的结合界面的电子势图相对较弱。为了解决这个问题，他们采用 “基于区块”的重建方法进行了聚焦分类和精细化处理，进一步提高了局部分辨率至3.9埃米，从而使得对相互作用模式的分析更为可靠。利用结合界面结构对H014和S蛋白之间的相互作用进行了详细分析。
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