【学术前沿】伊成器、宋春啸等全面总结DNA和R

作者：张馨予

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【学术前沿】伊成器、宋春啸等全面总结DNA和R

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迄今已鉴定的DNA和RNA修饰分别超过17种和160种，对这些修饰的生物学功能的兴趣促使表观基因组学（epigenomics）和表观转录组学（epitranscriptomics）的建立和发展。了解特定修饰在基因组或转录组上的精确定位是我们解析其生物学功能的关键。测序技术的发展使绘制DNA/RNA修饰图谱成为可能，但同时也引发了新的问题与思考。
近日，北京大学的伊成器团队和牛津大学的宋春啸团队合作在Protein & Cell发表特邀综述“Mapping the epigenetic modifications of DNA and RNA”，该篇综述详细总结了目前高通量DNA/RNA修饰检测技术的方法和发现，包括应用三代测序在单碱基水平鉴定修饰位点，并讨论了该领域存在的问题和今后研究的方向。

【学术前沿】伊成器、宋春啸等全面总结DNA和R

DNA修饰在个体发育【1】、衰老【2】和癌症【3】中发挥了重要功能。这些修饰并不干扰Watson-Crick配对原则，但能影响蛋白与DNA的结合。在哺乳动物基因组中，胞嘧啶的第5位碳原子的甲基化（5-甲基胞嘧啶，5-methylcytosine或5mC）是丰度最高的DNA修饰类型，也被称为“第5种碱基”【1】。5mC由DNA甲基化酶DNMTs催化，主要富集在CpG岛。虽然5mC的分布具有组织特异性，但70-80%的CpG岛都具有5mC修饰【4】。5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine或5hmC），也被称为第6碱基，由TET1酶氧化5mC而来。5hmC的进一步氧化产生5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。
与DNA类似，RNA也具有多种修饰，并且这些修饰参与了RNA代谢的各个方面。近年来利用高通量测序鉴定DNA/RNA修饰位点的技术极大地助力了表观基因组学和表观转录组学的研究。
单碱基水平的DNA修饰位点鉴定
1. 5mC的位点鉴定
重亚硫酸氢钠测序法（Bisulfite sequencing，BS-Seq）被认为是5mC鉴定的金标准，原理是重亚硫酸盐不影响甲基化C，却能将未发生甲基化的C转变成U（尿嘧啶），后者在PCR反应中变成T，并由此将甲基化C与未甲基化C区分开；再结合高通量测序技术，即可得到单碱基分辨率的全基因组5mC修饰图谱。重亚硫酸盐转换未甲基化C的效率高达99%，使得该方法的接受度最高【5-7】。然而，重亚硫酸盐处理会导致DNA的降解【8】，限制了它在稀少珍贵样品中的应用。另外，由于占基因组95%的未甲基化C转变成了T，降低了测序片段的匹配基因组的效率，也带来了覆盖度的偏好性。最后需要指出的是，BS-Seq并不能区分5mC和5hmC。
最近，两种无重亚硫酸盐的5mC鉴定方法被开发，分别是TAPS(TET-assisted pyridine borane sequencing)【9】和EM-seq（Enzymatic Methyl-Seq，EM-Seq）【10】，都利用TET酶对5mC的特异性氧化。TAPS的假阳性率比BS-Seq更低，能对少量DNA（1ng）进行检测；且配合过氧化氢钾可区分5mC和5hmC。EM-Seq利用了TET和DNA脱氨酶APOBEC3A，比BS-seq的灵敏度更高。
2. 5hmC，5fC和5caC的位点鉴定
深入了解5hmC、5fC和5caC的功能需要精确绘制其在基因组上的分布。oxBS-seq（Oxidative bisulfite sequencing）【11】和TAB-seq（TET-assisted bisulfite sequencing）【12，13】是改良的BS-seq，用于检测5hmC。hmC-CATCH（Chemical-assistant C-to-T conversion of 5hmC sequencing）【14】和ACE-Seq（APOBEC-coupled epigenetic sequencing【15】则是不依赖重亚硫酸盐的5hmC检测方法。5fC的检测方法包括fCAB-Seq（5fC chemically assisted bisulfite sequencing）【16】，redBS-Seq（reduced BS-Seq）【17】，MAB-Seq（methylase-assisted bisulfite sequencing）【18】和fC-CET（5fC cyclization-enabled C-to-T transition）【19】，CLEVERSeq（chemical-labeling- enabled C-to-T conversion sequencing）【20】（前三种方法是BS-seq的改良版，后两种方法则不依赖重亚硫酸盐）。5caC的检测主要采用CABSeq（Chemical modification-assisted bisulfite sequencing）【21】。值得注意的是，以上列举的测序技术都是基于化学的方法，将携带修饰或未被修饰的C转换为T，从而达到区分C是否携带修饰以及在单碱基水平鉴定DNA修饰位点的目的。
3. 基于抗体的DNA甲基化检测
基于抗体的DNA修饰位点鉴定是一种传统的，被广泛应用的较为简单的方法。目前5mC、5hmC、5fC、5caC均有商业化的抗体，可用于做DNA IP(DNA immunoprecipitation, DIP)。利用5hmC-DIP可鉴定癌症患者血液中循环DNA的5hmC【22】，说明此方法灵敏度高，无须耗费大量DNA，具有临床应用的潜力。但是DIP无法提供单碱基精度的DNA修饰分布位点，检测特异性非常依赖抗体本身的性质，且具背景（抗体与DNA的非特异性结合）较高，因此在进行DIP时，需设置严格的对照，并更谨慎地对结果进行验证。
4. DNA 6mA的测序鉴定
尽管6mA在哺乳动物基因组中的含量远低于5mC，近年来它仍然得到了越来越多的关注。DNA 6mA的测序主要依赖6mA抗体识别携带该修饰的DNA片段，该方法被证明具有较高的假阳性【23】。由于6mA是细菌中丰度最高的DNA修饰类型，因此哺乳动物中6mA的鉴定极易受细菌污染影响。虽然高精度无污染的质谱鉴定提示哺乳动物基因组DNA 6mA含量非常低，但是最近一项研究显示6mA富集在线粒体中并具有重要功能【24】。（近日，BioArt总结了哺乳动物6mA的研究历程和争议，详见：）