体外表达(二)：原理和技术要点[选购宝典]

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

续前：体外表达（一）：基因组学迈向蛋白质组学的桥梁

真核vs.原核

我们前面提到过，体外表达最常用的3类体系是原核的大肠杆菌体系，真核的兔网织红细胞体系和麦胚细胞体系。对于无细胞的体外表达，任何基因，只要序列上满足启动子和核糖体结合位点的要求，就可以用任一体系进行体外合成。3种不同选择，主要是为了满足优化的需要。在决定选择那种体系前，生物通带你首先来看看原核和真核的反应体系有哪些区别。

成份原核真核
Ribosomes 70S 80S
mRNA* SD 序列 5'-7 methyl-GTP cap，3'poly(A)tail，Kozak sequence
Elongator tRNAs, total prokaryotic eukaryotic
Initiator tRNA tRNAf Met ** tRNAiMet
20 individual ARSes prokaryotic eukaryotic
Initiation factors IF’s: 1, 2, 3 eIF’s: 1, 1A, 2, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 4F (4A+4E+4G), 5, 5A, 6
Elongation factors EF-Tu, EF-Ts, EF-G eEF1A, eEF1B, eEF2
Termination factors RF1, RF2, RF3, RRF eRF1, eRF3
Amino acids all 20 all 20
ATP and GTP*** + +
Mg2+ 8–15 mM 1–4 mM
K+ and/or NH4+ 100–250 mM ca. 100 mM
Other components All cell-free systems usually contain sulfhydryl compounds (ME, or DTT,or GSH), protease inhibitors, RNase inhibitors (e.g., RNAsin) and antiseptics(e.g., NaN3).****　
Buffer To maintain pH 7.4–8

** 原核（细菌）系统需要含有蛋氨酸（Met）tRNAf甲酰化亚系统，此亚系统包含有Met-tRNAf转甲酰酶和甲酰四氢叶酸或者与之同类的物质，例如：甲炔基四氢叶酸或者亚叶酸。

*** 在所有的体外表达体系中，都需要包含一个ATP/GTP再生亚系统（或者PEP+PK，或者CP+CK，或者AcP+AcK或者一个糖分解复合物）。

****　如果蛋白需要形成二硫键，系统需要包含一个GSH/GSSG混合物以保证维持体系的氧化还原势。

原核系统

原核系统主要利用大肠杆菌的提取物进行表达。近年来对大肠杆菌蛋白合成机制都有十分详细的认识，包括整个合成组分和反应的结构、遗传学、代谢和调节都了解的十分清楚。这使得大肠杆菌的体外表达也随之不断的得到改进。理论上任何遗传信息都可以在大肠杆菌体外表达体系中被翻译成多肽。根据生物通现有的数据，利用大肠杆菌体系进行体外表达，某些蛋白质每小时每个反应（50ul）产物量可高达数百微克，在优化的批量系统中蛋白最终的产量达到1mg/ml也是可能达到的，这一产率还可以通过连续反应器进一步得到提高。

大肠杆菌提取物系统有一个很大的优势就是它的耐受性，它可以在含有其它不同成份杂质时仍正常的工作。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂，分子伴侣，代谢物，非天然氨基酸甚至是少量的变性剂，也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。这样这种体系的弹性就非常大，可以加入许多其它优化成份以提高产率和提高溶解性。例如：修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键，然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定天然的修饰，比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是，蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍然是一个问题，特别是利用这一系统合成那些多结构域组成和二硫键的真核蛋白。不过，由于整个体外合成体系仍未解决这个蛋白质翻译后加工的问题，而大肠杆菌的材料来源成本最低，实用性高，表达效率也高，因而很快成为体外表达的最热门的选择。

真核系统

* 兔网织红细胞

兔网织红细胞可以说是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来，在体内主要是负责合成大量血红蛋白（90%以上），以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核，但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力，可减少背景，即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定，体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少，有助于长链RNA的稳定（包括有帽子或者没帽子结构的RNA），因而可以合成较大的蛋白。网织红细胞体系是最有希望做到微粒体糖基化的体系。