原代培养方法技术

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

本发明专利技术提供一种原代培养方法，其是在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的原代培养方法，其中，将从生物体采集的组织中的细胞接种至含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。
Primary culture method

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原代培养方法
本专利技术涉及对从生物体采集的组织中的细胞进行原代培养的方法。本专利技术特别是涉及对癌症患者的肿瘤组织来源的癌细胞进行原代培养的方法。本申请基于2017年8月21日在日本提出申请的日本特愿2017-158901号主张优先权，将其内容援引至此。
技术介绍
一直以来，在癌症研究中，使用在最适于培养的条件下进行传代培养而建立的细胞株的实验是主流。但是，长年来在生物体外维持、被持续培养的癌细胞株与原本的患者肿瘤组织相比，性质发生了变化，有可能无法说是充分地反映了生物体内的行为。于是，为了开发精度更高的抗癌剂、选择最适于每个患者的治疗，癌细胞的原代培养被认为是有希望的。例如，非专利文献1中介绍了使用原代培养细胞的CD-DST(Collagengeldropletembeddeddrugsensitivitytest，胶原凝胶微滴包埋药敏试验)法。该试验法是将从患者分离出的组织或细胞在胶原凝胶内进行包埋培养并进行验证的药物敏感性试验。但是，对于原代培养细胞，很难说已经确立了培养法，培养成功率低成为课题。作为从患者肿瘤组织对癌细胞进行原代培养的方法，为了抑制伴随细胞分散的细胞死亡(凋亡)，提出了在培养基中添加作为ROCK抑制剂的Y-27632的方法(非专利文献2)、或者获得在维持着细胞间黏附的状态下的一定尺寸的细胞团块并进行悬浮培养的方法(专利文献1)。这些培养法中，使用在干细胞用的无血清培养基中添加了血清代替物或各种增殖因子的培养基。但是，一般来说，干细胞用无血清培养基除了价格昂贵之外，还有在人为地大量添加有增殖因子的生长环境中将不同于实际生物体内的信号通路亢进或抑制的可能性。在这种环境下，特别是在使用了分子靶向药物的敏感性试验等中，有可能获得与实际生物体内不同的结果。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第5652809号公报非专利文献非专利文献1：Takamuraetal.,InternationalJournalofCancer,2002,Vol.98,p.450-455.非专利文献2：ZhangLetal.,PLOSONE,2011,vol.6,p.18271.非专利文献3：Nishiguchietal.,MacromolBioscience,2015,vol.15(3)，p.312-317.
技术实现思路
专利技术要解决的技术问题本专利技术的目的在于提供不特别地添加增殖因子或任何抑制剂、使用通常的细胞培养中使用的培养用培养基对从生物体采集的组织(生物体组织)中的细胞进行原代培养的方法。用于解决技术问题的手段本专利技术人们为了解决上述技术问题反复进行深入研究时发现，当在细胞外对从生物体采集的组织中的细胞进行培养时，在培养的初期，间质的存在是很重要的，从而完成了本专利技术。[1]本专利技术第一方式的原代培养方法是在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的原代培养方法，其中，将从生物体采集的组织中的细胞接种至含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。[2]可以将从所述生物体采集的所述组织的碎片化物、从所述生物体采集的所述组织的酶处理物、或者由从所述生物体采集的所述组织中回收的细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面来进行培养。[3]所述细胞结构体可以含有选自成纤维细胞、周细胞、内皮细胞及免疫细胞中的1种以上作为构成所述间质的细胞。[4]所述内皮细胞可以是选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上。[5]所述细胞结构体可以具备脉管网结构。[6]所述细胞结构体的厚度可以为5μm以上。[7]所述细胞结构体的厚度可以为150μm以上。[8]从所述生物体采集的所述组织可以含有肿瘤组织。[9]可以在将从所述生物体采集的所述组织进行碎片化之后，从所得的碎片化物中分选出癌细胞，将分选出的所述癌细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面上来进行培养。[10]在从所述碎片化物分选所述癌细胞时，可以利用选自流式细胞仪、磁性分离、介电泳、尺寸分级及密度梯度分级中的1种以上的手法来分选所述癌细胞。[11]可以通过以下工序构筑所述细胞结构体：在阳离子性缓冲液中，将至少含有构成间质的细胞的细胞与强电解质高分子及细胞外基质成分混合，获得混合物的工序(a)；将通过所述工序(a)获得的所述混合物接种在细胞培养容器中的工序(b)；以及在所述工序(b)后，在所述细胞培养容器中获得至少含有构成间质的细胞的细胞多层地层叠而成的细胞结构体的工序(c)。[12]本专利技术第二方式的含原代培养细胞的细胞结构体在含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的间质细胞层的顶面上具备由从生物体采集的组织中所含的细胞形成的细胞层。专利技术效果本专利技术上述方式的原代培养方法由于在模拟间质的细胞结构体的顶面培养生物体组织中的细胞，因此即便是不使用以往的原代培养那样的大量的增殖因子或特殊的抑制剂、而使用培养细胞株的培养中常用的通常的培养用培养基时，也能够以高的成功率进行原代培养。附图说明图1为实施例1中培养了2周后的经PKH标记的癌细胞株JC004的荧光图像。图2为实施例2中距离培养开始的第5天、第7天、第10天及第13天的经PKH标记的患者肿瘤组织来源JC-115细胞的荧光图像。图3为实施例3中在D-MEM培养基(10％FBS)中培养2.5周后的患者肿瘤组织来源JC-121细胞的荧光图像。图4为实施例3中在含Y-27632的StemPro培养基中培养2.5周后的患者肿瘤组织来源JC-121细胞的荧光图像。图5为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内并培养了5天的样品的5天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。图6为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面上并培养了5天的样品的5天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。图7为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面上并培养了5天的样品的EpCAM阳性细胞与总细胞数的比例(细胞数比、％)的测定结果的图。图8为表示实施例4中对于将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞在细胞层数为10层或20层的细胞结构体中进行了培养的样品、分选回收前后的EpCAM阳性细胞与总细胞数的比例(细胞数比、％)的测定结果的图。图9为实施例4中利用抗EpCAM抗体对直接接种于细胞培养容器的JC-052-3-liv细胞进行了荧光免疫染色的荧光图像。图10为实施例4中利用抗EpCAM抗体对由NHDF和HUVEC形成的20层细胞结构体进行了荧光免疫染色的荧光图像。图11为表示实施例5中以下样品的14天后增殖率(接种数比)的测本文档来自技高网...