Nat Methods ：神经顺行示踪工具介绍

作者：张馨予

　　众所周知，多种神经元之间会产生突触联系，形成神经网络。若探究某类神经元如何参与某脑功能，需知悉其上下游神经元，从而了解其精确的调控机制。为此，神经环路示踪技术，应运而生。

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　　然而，有关具细胞特异性神经示踪的工具，常见于逆行示踪，而鲜有顺行示踪。若通过染料或荧光蛋白以探究下游脑区，则无法排除passing by的神经纤维；若通过之前文章介绍过的CRACM手段顺向示踪，又难以胜任高通量需求。AAV1亦可跨突触表达，但其传递效率低，且不具备细胞特异性（可探究某脑区下游，不能探究某脑区中某类型神经元的下游，而后者的重要性不言而喻）。

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　　尽管不少工具病毒具备顺向跨突触的表达能力，但仅HSV-1 H129以顺向跨突触为主，且具以下两种缺点：可逆行传递、毒性强。因此，需要新型工具以规避这些缺点，进而实现单一脑区单一神经亚群的顺向示踪。

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　　2021.11.25日，《Nature Methods》杂志刊登了美国UTSW Wei Xu研究组的最新重要工作（Li et al., 2021），他们首次发现并改造了一种黄热病减毒活疫苗——YFV-17D以实现特定细胞类型的顺向示踪，极大提高了科研工作者的技术便利。下面，我们一起来学习精彩内容。

图片来源：Nature Methods

　　研究内容

　　YFV-17D的顺行示踪

　　为探究YFV-17D的顺行示踪能力，作者选择了一条well-characterized pathway——前额叶皮层（PFC）-纹状体（Striatum, CPu）-黑质（SN）环路。他们在小鼠PFC内注射YFV-mVenus，6天后CPu内可见mVenus阳性神经元，几天后SN内可见mVenus阳性神经元（图1a-d）。他们还发现，YFV-mVenus在6-7天内不具逆行示踪的副作用（图1e-f）。

　　为实现单一细胞类型的顺行示踪，作者开发了replication-deficient YFV△NS1-mVenus。无NS1时，mVenus不表达；只有在目标脑区（PFC）及下游脑区（CPu）均注射AAV-NS1（实现细胞特异性需使用AAV-DIO-NS1）时，（注射于PFC的）YFV△NS1-mVenus才能表达并示踪；此外，YFV△NS1-mVenus不会或极少通过轴突末梢表达（图1g-l）。

　　为探究YFV△NS1-mVenus是否具有逆标副作用，作者在CPu内注射此病毒，在小鼠PFC及CPu内注射AAV-NS1。他们发现，6天后PFC内无mVenus阳性神经元，而12天后PFC可见mVenus阳性神经元，表明时间足够长时YFV△NS1-mVenus具逆标能力。

图1 YFV-17D的顺行示踪

　　通过诱导复制YFV-17D实现特异性顺行标记

　　上文已知，当表达时间足够长时，YFV-17D可以逆行标记。为规避此缺点，作者引入TRE-rtTA系统以严控表达时间窗口（图2a,b）。他们在小鼠PFC与CPu内注射AAV-rtTA与AAV-TRE-NS1，在CPu内注射YFV△NS1-mVenus，每三天腹腔注射Dox，12天后灌注小鼠（图2c）。他们发现mVenus在CPu而非PFC内表达（图2d-f），表明通过此方法可规避YFV-17D的逆标特性。

　　那么，通过这种办法，可以实现跨突触表达神经操控元件或探针吗？可在全脑范围实现某类神经元的顺行单级跨突触示踪吗？