欧易生物单细胞测序助力解析肝癌γδ T免疫异质



2022年3月21日,中山大学附属第一院器官移植中心高伊昉教授何晓顺教授与暨南大学附属珠海市人民医院吴扬哲教授、尹芝南教授陆骊工教授等合作,在Clinical and Translational Medicine(IF:11.492)发表了肝细胞癌单细胞测序相关的研究。该篇文章中,中山大学附属第一院何文靖博士与暨大基础医学院胡怡副教授为共同一作,欧易生物提供了该篇文章的单细胞转录组测序和分析工作

欧易生物单细胞测序助力解析肝癌γδ T免疫异质

材料:肝脏灌洗液

期刊:Clinical and Translational Medicine

发表时间:2022年3月21日

方法:欧易生物10× Genomics scRNA-seq

研究背景

原发性肝癌以肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)为主。在全球范围内,HCC是导致癌症相关死亡的第四大常见原因,在发病率方面排名第六。鉴于HCC对传统化疗药物易产生治疗抵抗,免疫治疗在HCC中备受期待。γδ T细胞能够特异性靶向肿瘤细胞而不伤及正常细胞的优势特点引起研究者们极大关注,而γδ T细胞浸润的有效性可能与HCC的进展和患者的预后相关。进一步研究观察到,γδ T细胞在HCC中的浸润程度低于肿瘤周围组织。有趣地是,作者还在前期临床研究中发现,Vδ2 T细胞治疗可以显著减缓患者HCC进展。然而,γδ T细胞在HCC肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)和正常肝组织中的功能差异仍不清楚。因此,为进一步表征和区分浸润性γδ T细胞的免疫异质性图谱,并揭示其功能复杂性和在HCC中的转化演变,作者收集HCC患者以及健康人肝灌洗液进行单细胞测序,为未来治疗HCC免疫疗法提供参考。

内容概述

作者使用磁珠富集来自HCC患者和健康人肝灌洗液中的CD3CD161 T细胞进行单细胞测序,结果发现HCC患者中具有一群表达细胞毒性但接近耗竭状态的γδ T亚群,进一步针对该亚群进行功能富集以及拟时序等分析,发现该亚群LAG3耗竭标记基因以及谷氨酰胺等相关代谢通路显著上调,细胞增殖等相关通路下调,细胞周期停滞在G2/M期。进一步分析该亚群TCR多样性与克隆型,发现相比健康对照组HCC组明显丢失。作者将以上结果与前期实验结果联系,发现来自健康供者的Vδ2 T体外扩增后能够挽救HCC浸润性γδ T细胞的功能和代谢缺失。

研究内容解析

浸润性γδ T细胞聚类及亚型分析

作者首先从HCC患者和健康人肝灌洗液中富集CD3CD161 T细胞,接着针对富集得到的细胞进行单细胞测序(图1A),并根据TRDC从测序结果中鉴定出γδ T细胞,进一步将γδ T细胞群降维聚类得到6个亚群(图1B)。对γδ T亚群样本来源进行统计分析,发现C4几乎全部来源于HCC患者(图1C)。针对各亚群进行差异分析,发现在top10差异基因中,C4高表达耗竭性标记基因LAG3以及毒性标记基因NKG7、GNLY、GZMB和IFNG,表明该亚群在HCC中具有细胞毒性但接近耗竭的特点。此外,作者发现,C0、C1、C2、C3均主要分布在健康肝脏中,分别表达效应记忆T细胞、效应T细胞、记忆T细胞等标记物,C5仅在健康肝脏中检测到,并且高表达naïve T细胞标记物(图1D, E)。这些结果表明,HCC患者相比于健康人的γδ T细胞亚群其多样性发生丢失。进一步针对各亚群差异基因进行富集分析,发现C4中谷氨酰胺代谢和凋亡通路显著上调,TCR信号转导、中心代谢途径(例如:糖酵解、氧化磷酸化)下调,提示HCC内γδ T 细胞的代谢重编程和效应功能的丢失(图1F, G)。

欧易生物单细胞测序助力解析肝癌γδ T免疫异质

图1 | 单细胞测序分析HCC和健康肝脏中肿瘤浸润性γδ T细胞

HCC浸润性γδ T细胞TCR多样性发生丢失

根据文献报导,TCR多样性与肿瘤进展呈负相关。作者从单细胞测序结果观察到,与健康肝脏相比,HCC肝脏中TRDC γδ T细胞显著减少(图2A),TCR(TRGV)多样性明显丢失(图2B)。同时,γδ T细胞TRGV、TRGC、TRDV变体在各亚群中的表达证明了C4中TCR多样性普遍丢失(图2C)。TCR克隆型分析结果表明,C4中超过69%的细胞都只能检测到一个TCR克隆型(图2D)。作者将单细胞结果HCC γδ T与已发表的γδ T细胞分类:Vδ1和Vδ2(分别记为基因集1和基因集2)进行比较,结果发现HCC浸润性γδ T细胞与Vδ1的表达谱更为接近(图2E)。然而,Vδ1和Vδ2总体基因集活性都低于健康组,这表明TCR多样性在HCC中总体丢失。进一步利用激光共聚焦显微镜在HCC和癌旁组织切片中观察浸润性Vδ1和Vδ2 γδ T细胞,同样发现HCC浸润性Vδ2 γδ T细胞减少(图2F)。此外,作者还利用HCC患者和健康人的肝灌洗液,基于Th1、Th2和Th17趋化因子的表达CD183 (CXCR3)和CD196 (CCR6)分析γδ T亚型,流式分析结果表明HCC浸润性γδ T细胞中Th1群体显著减少,意味着细胞毒性功能的丢失(图2G)。前期文献报导,Vδ2表现为毒性(Th1样)亚型,而Vδ1在肿瘤发展中的作用仍存在争议。作者的研究结果表明,在HCC中,γδ T细胞的毒性被削弱,而TCR多样性的丢失可能导致γδ T细胞功能多样性的丢失以及在TME中的应答能力的丢失。

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图2 | TCR多样性及克隆型分析

γδ T细胞的发育轨迹




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