激光荧光推动测序技术发展

作者：杨超月

DNA测序，无论从何种角度而言，都着实代表了生物检测最具活力的领域。尽管已历经25年发展，测序技术却没有合并为某种单一基本方法，而是发展出日益丰富的多样化技术（请参阅文章底部"表达谱和综合测序"）。然而，激光激发的荧光技术依然是最为流行的检测方法。事实上，激光荧光技术在基因测序的发展中担任着关键的角色，测序环境的飞速变化也正在推动重要的产品趋势。

从Sanger法说起

首个成功测定一段DNA序列的方法是链终止法，又称Sanger法。此方法在四种不同的脱氧核糖核苷碱基和一种低浓度的链终止核苷酸中，使用聚合酶复制单链DNA；链终止核苷酸已经过化学改性，因而聚合酶可吸收其中一种核苷酸，但其结构将阻止进一步合成。结果将从原始引物序列产生不同长度的片段，从仅含几个碱基到与原始单链等长。对终止核苷酸进行放射性标记并在硅胶板中分散复制片段后，序列可在曝光照片底板上呈现为具有四种独特条纹（腺嘌呤[A]、胞嘧啶[C]、鸟嘌呤[G]、胸腺嘧啶[T]）的"条形码"。

该方法通过第一代仪器实现了自动化，其原理为改用荧光标记的链终止核苷酸（用四种不同的荧光标记四种碱基），通过毛细管电泳法(CE)区分各复制片段的长度，随后用激光荧光（通常为488 nm）识别A、C、G、T（参见图1）。

激光荧光推动测序技术发展

图1. 最初的Sanger测序法在聚合反应终止处开始，用放射性核苷酸进行标记，随后在凝胶隔板上通过电泳法区分长度。该方法随后改用荧光核苷酸标记、毛细管电泳区分和激光检测，从而实现了第一代自动化测序法。

每一轮仅可测序几百个碱基。因此，整个人类基因组的读取工作由多个实验室共同承担，每个实验室运行多个测序器，总成本约30亿美元，历时长达10年。

第二代：大规模并行计算

难以置信的是，测序完整人类基因组的成本已降低近七个数量级，现在每个完整人类基因组的测序成本不到1，000美元。第三代仪器的开发商甚至更进一步，可将成本继续降低至十分之一。

第二代测序(NGS)仪器所使用的大规模并行计算，是推动速度和成本革新的重要一步。经过验证，两种最为流行的第二代测序方法分别由Illumina公司（加利福尼亚州圣地亚哥）和Life Technologies公司（加利福尼亚州卡尔斯巴德）开发。这两种方法均首先将目标DNA切分成易于处理的单链，每条单链通常含数百个碱基。随后，将这些单链排列成某种互不重叠的阵列，并在原地进行放大，即通过聚合酶链反应(PCR)或克隆形成小型群集，每个群集仅含一种单链且由该种单链的诸多相同复制品构成。随后用百万级像素的传感器以荧光法跟踪测序，因此可以同时分析多达数万甚至数十万个群集的激光荧光。Life Technologies公司使用连接（切断）测序法，而Illumina公司采用合成测序法(SBS)。后者已成为市场领导品牌，部分得益于其旗舰版仪器的超高通量，每日测序量可达6，000亿个碱基，非常适用于全基因组测序及其他类似应用领域。

激光荧光推动测序技术发展

图2. Pacific Biosciences RS II测序仪。每个零模式波导(ZMW)含一个单一聚合酶（图a）。通过将激光分离指向各个ZMW的众多衍射极限光斑，可在一个SMRT芯片上同时实时模拟和监测多达150，000个ZMW（图b）。（图片由Pacific Biosciences公司提供）

这两种方法的测序均在由激光激发的玻璃板上或流动池中进行。每种核苷酸（A、C、G和T）均有唯一的荧光发射剖面。因此，每一个独特的群集均会以特定的波长模式闪烁，即在其成像位置会呈现为不同颜色，以对应下一个将要切断(Life Technologies)或合并(Illumina)的碱基。结合使用二向色滤光片和低噪点数码相机检测，可在每个化学周期内，同时对数百万个群集序列的碱基进行逐一读取。随后，计算机将从这些随机排列的群集中对比所有序列，并将其与已知/预期的基因组序列进行对比，以组成最初未剪切的DNA完整序列。

遗传学/DNA测序（续）

激光荧光推动测序技术发展

图3. 仪器制造商常常寻找整合型激光器和光束传输解决方案，有时还希望产品可以提供多种激光波长。相干公司的Galaxy解决方案提供现成便捷的技术，使用八个波长专用的即插即用输入接口，将多个激光器的输出合成到单个输出光纤中。

第三代：

技术多样性