金黄色葡萄球菌arl双组分信号转导系统受体蛋白

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

金黄色葡萄球菌是极具危害的人类病原菌，具有较高的致死率[]，约有30%的正常人群也长期携带着该菌[]。金黄色葡萄球菌可引起伤口的化脓感染，亦可诱发内脏器官感染，导致肺炎、心内膜炎及脓毒血症等疾病[-]，致使病人免疫能力降低甚至死亡。目前，医院主要通过抗生素来治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病感染。近几十年，先后出现了耐青霉素菌株、耐甲氧西林菌株和耐万古霉素菌株等耐药性菌株，这些超级细菌的出现为相关疾病的治疗带来了巨大的困难，因此发现抗菌靶点和开发新的抗菌药物迫在眉睫[-]。

金黄色葡萄球菌的致病机制与其能分泌多种细胞外毒素及胞外酶密切相关[, ]，而这些毒力因子的表达受多个基因组成的网络调控，过程十分复杂。研究表明，agr、srr、arl、sae、lyt、wal等多个双组分信号转导系统均参与这些毒力因子的调控过程[]，其中arl系统是最重要的双组分信号转导系统之一。arl系统由组氨酸激酶蛋白ArlS和反应调控蛋白ArlR构成[-]，ArlRS可作为全面调控因子，直接或间接调节多种基因的表达[]，与金黄色葡萄球菌的致病性密切相关。我们利用在线软件预测ArlS蛋白含有两个跨膜片段和一个较大的胞内域结构()，蛋白质胞内域部分含有两个结构域分别是组氨酸自身磷酸化位点和ATP结合的激酶功能区；ArlR包含两个结构域，N端含有接受自组氨酸蛋白激酶转移的磷酸基团位点，C端有含DNA结合位点的效应区[, -]。

图 1 AgrC蛋白和ArlS蛋白二级机构预测及同源性分析图 Figure 1 The homogeneity analysis result and the putative periplasmic region of ArlS and AgrC proteins (a) The putative periplasmic region of ArlS and AgrC proteins. The transmembrane segments, dimerization and histidine phosphotransfer regions (DHP) subdomain, and catalytic and ATP-binging (CA) subdomain are indicated by purple, blue and red boxes, respectively (b)The homogeneity analysis result of AgrC and ArlS

ArlRS双组分系统的信号传递通过组氨酸激酶ArlS磷酸化实现，组氨酸的磷酸基团转移到反应调节蛋白接受域的天冬氨酸残基上，从而调控目的基因的表达或目的蛋白的功能发生适应性变化。ArlS蛋白可以捕捉胞外信号并且能够发生磷酸化，启动信号转导过程[-]，因而ArlS的胞内域被认为是调控毒力因子表达的重要功能域。

ArlS蛋白属于组氨酸激酶蛋白，文献报道[]该蛋白质与双组分信号转导系统中的其他组氨酸蛋白具有同源性。经过序列的同源性分析，结果显示ArlS蛋白与AgrC蛋白具有较高的同源性。目前对于AgrC蛋白的研究较为透彻，已经成功解析了AgrC蛋白CA域(结合ATP并磷酸化组氨酸残基的C端催化域)的晶体结构[]。有文献介绍[-]AgrC蛋白的394位和396位氨基酸残基在其自磷酸化过程中起着关键作用，根据同源性比对分析结果推测ArlS蛋白的418位和420位氨基酸残基可能是ArlS蛋白自磷酸化过程中的具有重要功能的氨基酸。由于ArlS蛋白控制磷酸化的功能域位于蛋白质胞内域部分，因此本文首先以ArlS蛋白的胞内域部分即ArlSCA(残基数294~451)为目标蛋白，进行相关的活性研究。同时，本文利用定点突变的研究方法，构建了418位和420位氨基酸残基突变的ArlS蛋白即ArlSCAG418A和ArlSCAG420A，并利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法测定激酶活性，以检测418位和420位氨基酸残基在ArlSCA蛋白自磷酸化过程中的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究所用引物均由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成，限制性内切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4 Ligase均购自大连宝生物工程公司。

1.2 ArlSCA、ArlR、ArlSCA-G418A及ArlSCA-G420A表达载体的构建

根据NCBI登记的ArlS和ArlR蛋白的碱基序列，以及载体pProEX-HTa的多克隆酶切位点，利用clone manager软件设计上下游引物，分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点。ArlR的引物信息如下：上游引物F-ArlR:5′-GGGCCATGGATATATGACGCAAATTTTA-3′(划线部分为NcoⅠ酶切位点)；下游引物R-ArlR:5′-GGGCTCGAGTCATCGTATCACATACCC-3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)。ArlS的引物信息如下：上游引物F-ArlSCA:5′-GGGCCATGGATAAAGGAGATGTAAATGAC-3′(划线部分为NcoⅠ酶切位点)；下游引物R-ArlSCA:5′-GGGCTCGAGTTAAAATATGATTTTAAA-3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)。ArlS蛋白的第418位、420位氨基酸G突变为A，构建418位突变菌株ArlSCA-G418A和420位突变菌株ArlSCA-G420A。ArlSCA-G418A的引物信息如下：上游引物F-ArlSCA-G418A:5′-CAAGGCGGTAATGCGCTCGGATTATCT-3′；下游引物R-ArlSCA-G418A:5′-AGATAATCCGAGCGCATTACCGCCTTG-3′。ArlSCA-G420A的引物信息如下：上游引物F-ArlSCA-G420A:5′-GGTAATGGTCTC GCGTTATCTATTGCG-3′；下游引物R-ArlSCA-G420A:5′-CGGAATAGATAACGCGAGTCCATTACC-3′。