基因组从头测序（De novo sequencing）

作者：杨超月

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基因组从头测序（De novo sequencing）
基因组从头测序（De novo sequencing）
基因组从头测序，是指在不依赖参考基因组的情况下对某物种进行基因组测序，然后应用生物信息学手段对测序序列进行拼接和组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为后续从基因组学水平研究物种的生长、发育、进化、起源及特定环境适应性奠定基础，同时也为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台，为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息，从而对基础生物学、分子育种、遗传基因改良等方面的研究起到巨大的推动作用。
采用传统的Sanger法测定高等动植物的全基因组需要花费大量的人力和物力资源，这极大限制了全基因组测序的发展。2007年6月，DNA 双螺旋结构的发现者James Watson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是第一次使用非Sanger测序的高通量测序方法获得了人类个体基因组序列，并且第一次将个人基因组序列公之于众。整个测序过程在两个月之内就完成了，花费不到100万美元，这只占耗时10年之久的人类基因组计划使用经费的千分之一，或是相当于Venter基因组计划费用的百分之一。此后，第二代高通量测序技术的成熟和广泛应用，大大降低了基因组测序的成本，缩短了测序时间，让更多实验室可以独立开展动植物基因组测序项目。

技术路线

根据物种基因组的复杂度，特别是重复区域的大小和数量等信息，科学的制备各种长度插入片段的测序文库，合理的使用不同的高通量测序技术，能够高效经济的完成高等动植物的基因组图谱绘制。De novo测序的主要策略：一是对短片段Shotgun文库（300-1000 bp）进行深度测序，确保序列覆盖度和测序准确性，获得基因组基本序列信息；二是构建较长插入片段度的mate pair文库（3kb、8 kb、10 kb、20 kb等等）并测序，确定短片段序列间的相对位置，通过拼接组装获得基因组序列框架；三是通过PCR扩增技术获得序列间断开部分（gap）DNA片段并进行一代测序，从而获得完整基因组序列。

基因组从头测序（De novo sequencing）

生物信息分析
1. 基因组拼装统计
提供基因组拼装的基本信息，包括原始数据统计、测序覆盖率统计、Contig N50大小、Scaffold N50大小、基因组GC含量等信息。
2. 基因组注释
包括基因预测、基因功能注释（同NR、Swiss-Prot、Interpro等数据库进行同源比对）、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。
3. 基因功能分类
GO分类、KEGG通路分析等。
4. 比较基因组学及进化分析
通过比较相近物种的基因组数据，从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标基因组进行分析。
5. 建立数据库
建立符合国际标准且具有良好兼容性的基因组数据库，实现基因组数据的查询与共享。

数据挖掘
1、动植物进化分析
基因家族鉴定（动物TreeFam、植物OrthoMCL）；
物种系统发育树构建；
物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；
基因组共线性分析；
全基因组复制分析（动物WGAC、植物WGD）。
2、微生物高级分析
基因组圈图；
共线性分析；
基因家族分析；
CRISPR预测；
基因岛预测；
前噬菌体预测；
分泌蛋白预测。

技术指标
1. 动植物基因组指标
基因组大小（Genome Size, GS） 组装指标
GS ≤ 300 Mb Contig N50 ＞ 20 kb, Scaffold N50 ＞ 300 kb
Contig N50 ＞ 10 kb, Scaffold N50 ＞ 150 kb
300 Mb ＜ GS ≤ 1500 Mb（鸟类除外） Contig N50 ＞ 20 kb, Scaffold N50 ＞ 300 kb
Contig N50 ＞ 10 kb, Scaffold N50 ＞ 150 kb
1500 Mb ＜ GS ≤ 3000 Mb
（哺乳动物除外） Contig N50 ＞ 10 kb, Scaffold N50 ＞ 150 kb
Contig N50 ＞ 5 kb, Scaffold N50 ＞ 20 kb
GS ＜ 1600 Mb（鸟类） Contig N50 ＞ 20 kb, Scaffold N50 ＞ 300 kb
GS ＜ 3200 Mb
（哺乳类，除翼手目除外） Contig N50 ＞ 20 kb, Scaffold N50 ＞ 300 kb
复杂基因组 Contig N50 ＞ 20 kb, Scaffold N50 ＞ 300 kb