梨PbrNSC基因及其应用




梨pbrnsc基因及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域,涉及梨pbrnsc基因及其应用,具体涉及从

砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞次生细胞壁发育的pbrnsc基因。


背景技术:

2.梨属(pyrus l.)植物属于蔷薇科(rosaceae)、桃亚科(amygdaloideae)、苹果族(maleae)、苹果亚族(malinae)(滕元文,2017),是一种重要的果树作物,在中国有3000多年的栽培历史(lombard,1987)。全世界范围内认可的梨属植物至少有22种,其中白梨(pyrus bretschneideri)、砂梨(pyrus pyrifolia)、秋子梨(pyrus ussuriensis)、新疆梨(pyrus sinkiangensis)和西洋梨(pyrus communis)是主要的栽培种(vavilov,1951)。白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨由于主产区在中国、日本等亚洲国家,所以也被统称为“东方梨”或“亚洲梨”;而西洋梨是西方国家的主要栽培种类,所以也被称为“西方梨”。我国是梨生产大国,生产面积和年产量均占世界总量的70%以上,但我国梨果品出口量和出口价格都远低于日本还有西方国家,在国际市场上的竞争力较弱,究其原因主要是由于我国梨果的综合品质较差,肉质粗糙。因此,梨果实品质的改良和提升一直是育种工作者关心的首要问题。
3.在众多影响果实品质的因素中,石细胞是梨果实中特有的性状,大量形成的石细胞严重影响了食用口感和加工品质。石细胞在果实发育早期出现,由薄壁细胞发育而来,属于厚壁组织细胞,果肉中常以单个或成簇的形式存在(tao et al.,2009)。厚壁细胞的初生细胞壁和原生质膜之间会形成相对较厚,并且坚硬的次生细胞壁。与初生细胞壁不同的是,次生细胞壁的纤维素聚合程度较高,且含有木聚糖和大量的木质素、酚醛树脂。木质化的次生细胞壁赋予导管细胞一定的机械硬度和疏水性,推动着低等植物向高等植物的进化过程(heyn,1955;heyn,1965;heyn,1966)。然而,在造纸工艺中次生细胞壁中的木质素需要大量的强酸和碱等化学物质来去除,不但增加了生产成本,还会造成严重的环境污染。由此可见,厚壁细胞次生细胞壁形成机制的探索成为基础科学领域普遍关注的科学问题,同时也是制约梨果实石细胞性状改良关键问题。果实石细胞的合成代谢途径非常复杂,不仅涉及多种组分的合成代谢以及相互转换关系,且涉及的基因众多、每个基因还包含多个拷贝(zhong et al.,2018),可见果实石细胞形成是多基因协同调控的最终结果,这无疑对我们力图通过传统杂交育种实现石细胞性状的改良产生了巨大影响,在短期内尚无法满足产业发展和市场对优质梨果的需求。随着现代基因组与分子操作技术的快速发展及其在果树领域的广泛应用,结合分子育种技术手段,进行定向遗传改良和分子筛选无疑是提高育种效率的最有效解决方案,而阐明石细胞形成的分子机制、获得关键的调控基因则成为实现该路径的必要基础和前提。
4.申请者使用基因共表达网络与eqtl分析方法相结合,对206份梨种质资源果实石细胞形成关键时期转录组数据进行深度挖掘,从中发现了一个新基因(pbrnsc)。通过在梨果实中瞬时过量表达以及基因沉默技术,证实了pbrnsc可以改变果实石细胞次生细胞壁的合成过程;过量表达pbrnsc的转基因拟南芥花序茎中,次生细胞壁的主要组成成分——纤
维素、木质素及g型木质素单体含量显著增加,导管和束间细胞的次生细胞壁显著加厚。由此证明pbrnsc基因参与调控梨果实石细胞次生细胞壁的形成。该基因的发现为改良梨果实石细胞含量提供理论基础,并为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低次生细胞壁中木质素含量提供基因资源。


技术实现要素:

5.本发明的目的是提供一个调控梨果实石细胞次生细胞壁发育的pbrnsc基因。
6.本发明的另一目的是提供该基因的应用。
7.本发明的目的可通过以下技术方案实现:
8.一个分离自

砀山酥梨’具有促进石细胞中木质素合成的pbrnsc基因,其核苷酸序列为seq id no.1所示,包含1203bp的开放阅读框;编码400个氨基酸,其编码的氨基酸序列为序列表seq id no.2所示。
9.含有本发明所述pbrnsc基因的重组表达载体。
10.所述的重组表达载体,以pcambia1301为出发载体,所述pbrnsc基因的插入位点为xba i和bamh i之间。
11.含有本发明所述pbrnsc基因的宿主菌。
12.克隆本发明所述pbrnsc基因cdna序列的引物对,上游引物pbrnsc-f1序列如seq id no.3所示,下游引物pbrnsc-r1序列如seq id no.4所示。
13.本发明所述pbrnsc基因在促进石细胞次生细胞壁合成中的应用。
14.本发明所述的重组表达载体在促进石细胞次生细胞壁合成的应用。
15.有益效果
16.与现有技术相比,本发明具有以下优点和效果:
17.pbrnsc基因的发现,不仅为改良梨果实石细胞含量提供理论基础,更为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低木质素含量提供基因资源,甚至能为实施绿色农业提供新的遗传资源,该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。
18.通过农杆菌介导的转化方法,将pbrnsc基因在梨幼果及拟南芥中进行功能验证,结果表明pbrnsc基因具有同时调控多个木质素合成通路酶基因的优点,为分子遗传改良和育种提供更高效地途径。
附图说明
19.图1为本发明实施例1的载体示意图。
20.图2为本发明pbrnsc基因瞬时注射梨幼果的功能分析。
21.其中:a和b,砀山酥梨’不同样品中pbrnsc基因的相对表达量。c,瞬时表达pbrnsc基因的梨果实切片经间苯三酚染色。d和e,梨果肉纤维素和木质素含量。f-i,次生细胞壁生物合成相关基因的表达量。
22.图3为本发明pbrnsc基因在转基因拟南芥植株中功能分析。
23.其中:wt:野生型;其余编号:转基因株系。a-c,野生型及转基因拟南芥植株生长发育八周后花序茎的纤维素含量(a)、木质素含量(b),木质素单体含量(c)。d-g野生型及转基因拟南芥植株生长八周后花序茎的组织学分析:甲苯胺蓝染色指示细胞形态结构;
wiesner,以及uv光检测木质素沉积空间分布;congo red检测纤维素沉积空间分布;e-g,透射电镜检测次生细胞壁厚度及其统计分析。h-i,pbrnsc基因超表达影响次生细胞壁合成相关基因的表达。
具体实施方式
24.以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例,本领域技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不偏离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做出各种改变和修改,以使其适用各种用途和条件。
25.实施例1 pbrnsc基因分离克隆与超表达载体的构建
26.取3μg

砀山酥梨’早期果肉rna,用one-step gdna removal and cdna synthesis kit(transgen,china)进行反转录,方法参照说明书。根据pcambia-1301载体的多克隆位点和pbrnsc基因的编码区序列上的酶切位点分析,选择xba i和bamh i作为内切酶。按照一般设计引物的原则用snapgene软件设计出带有酶切位点的引物seq id no.3和seq id no.4。50μl的反应体系中包括200ng cdna,1
×
缓冲液(gxl buffer),0.2μm dntp,1.25u gxl聚合酶(gxl dna polymerase)(前述缓冲液和gxl dna聚合酶购自takara公司),0.2μm上述引物。pcr反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成:98℃,预变性3分钟,98℃变性10秒,60℃退火15秒,68℃延伸90秒,35个热循环,68℃延伸10分钟,16℃保存。
27.pcr产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后,用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪,按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收dna片段。pcambia1301载体的双酶切体系总体积为50μl,其中含有经过质粒提取获得的pcambia1301载体质粒10μl,10
×
buffer(购自neb公司)5μl,xba i 1μl,bamh i 1μl及水33μl。于37℃酶切3小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pcambia1301与pbrnsc基因使用重组酶exnase ii(购自vazyme公司)于37℃连接30分钟。反应总体积20μl,其中含有5
×
ce ii buffer 4μl,exnase ii 2μl,pbrnsc基因的pcr回收产物2μl,pcambia1301载体的双酶切回收产物6μl及水6μl。取连接产物10μl转化大肠杆菌感受态dh5α,在含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板中筛选出阳性克隆,抽提质粒进行酶切及pcr鉴定,重组质粒样品送生物公司测序。测序结果表明,pbrnsc的cds全长为1203bp,其核苷酸序列为seq id no.1所示,能编码400个氨基酸残基的蛋白,序列为seq id no.2所示。我们将重组载体命名为35s-pbrnsc-gfp,构建完成的载体图谱见图1所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌gv3101中。
28.实施例2 pbrnsc基因时空表达模式分析
29.‘
砀山酥梨’不同组织样品采自江苏省高邮果园(2015年)。总rna的提取采用ctab法(porebski et al.,1997),并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总rna,用one-step gdna removal and cdna synthesis kit(transgen,china)进行反转录,方法参照说明书。荧光定量pcr所用引物为基因特异引物对:seq id no.5和seq id no.6;以gapdh为内参基因,荧光定量试剂盒购自roche公司。real-timepcr所用仪器为roche 480定量pcr仪,反应体系为:2
×
sybr greeni master mix 10μl,上下游引物(10μm)0.4μl,2μlcdna,7.2μlpcr级别的水。反应条件为95℃变性5min;95℃预变性5s,60℃退火
5s,72℃延伸10s重复45个循环;熔解曲线分析65℃到95℃,每5s升高1℃。
30.有研究表明梨果实发育的早期阶段和茎秆的维管组织中有大量次生细胞壁的合成(xue et al.,2019)。我们检测了pbrnsc基因在梨不同组织样品中的转录水平,结果显示pbrnsc基因在花后21至49天的果实,还有茎秆中有较高的转录水平(图2a-b)。由此说明,pbrnsc的表达模式与次生细胞壁生物合成的时间和空间相一致,很有可能参与茎杆和果肉石细胞中次生细胞壁的合成。
31.实施例3梨果实瞬时转化
32.用含有pbrnsc过量表达或基因沉默载体的农杆菌,通过农杆菌介导法注射到花后35天左右的

砀山酥梨’,方法如下:
33.1、将含有正确质粒的农杆菌于固体培养基上活化,在温度为28℃的培养箱中生长48小时;
34.2、在100ml锥形瓶中加入30ml含有r
+
与k
+
的液体lb培养基,用枪头挑入活化的农杆菌,在28℃、200rpm的摇床中生长12小时;
35.3、将菌液倒入50ml离心管6000rpm离心15分钟收集全部菌体;
36.4、用适量的诱导介质(10mm mgcl2、10mm mes、200mm乙酰丁香酮,ph 5.6)重悬沉淀,调整od值在0.8-1.2,室温中用脱色摇床诱导4个小时;
37.5、将侵染液注入到花后35天左右的梨果实中,每次至少注射10个果实,试验进行三次生物学重复;
38.6、暗培养24小时,再放到光周期为16小时光照/8小时黑暗的培养箱中,温度保持22℃,培养7-10天;
39.7、组织学分析
40.用刀片切开果实,间苯三酚-盐酸染色,具体步骤如下:
41.a、首先用30%盐酸溶液(v/v)处理1分钟;
42.b、10%间苯三酚溶于80%乙醇(w/v);
43.c、再滴到已经过盐酸处理的切片上,染色5分钟;
44.d、最后用足量的水清洗终止反应。
45.间苯三酚-盐酸染色发现,过量表达pbrnsc的部位木质素染色效果明显增强,基因沉默pbrnsc的部位木质素染色效果明显受到抑制(图2c)。
46.实施例4纤维素、木质素含量检测
47.纤维素含量的测量方法具体如下:取0.2g样品置于烧杯中,将烧杯置于冷水浴中,加入60ml的60%h2so4,然后消解30分钟。接着将消解的纤维素溶液转移到100ml容量瓶中,并用60%h2so4调控至蚀刻线,充分振荡,并使用布氏漏斗过滤到单独的烧杯中。将5ml滤液加到100ml容量瓶中,在冷水浴上用蒸馏水稀释,并充分摇动。然后将2ml溶液转移到试管中,向其中加入0.5ml 2%的蒽酮试剂和5ml浓h2so4。充分摇动混合物,静置12分钟。最后在620nm处测量吸光度,并参考针对微晶纤维素(macklin)计算的标准曲线确定石细胞中的纤维素含量。对于每个梨品种,进行3次独立的测量。木质素含量参照溴乙酰法,木质素含量用测定值/所用样品重量的百分数表示(acker et al.,2013)。过量表达pbrnsc的果肉纤维素和木质素含量显著升高,但抑制pbrnsc的转录水平显著抑制果肉纤维素和木质素的合成(图2d-e)。
48.实施例5石细胞次生细胞壁生物合成相关基因的表达量检测
49.rna的提取、cdna的合成、荧光定量pcr的体系及步骤参照实施例2。瞬时转化法调控梨果实pbrnsc基因表达水平,会显著改变次生细胞壁合成基因pbr4cl4,pbrcse1,pbrccoamt1,pbrf5h,pbrlac4,pbrcsea8a及pbrcsea7a的转录水平(图2f-i)。
50.表1梨实时荧光定量引物
[0051][0052][0053]
实施例6拟南芥的遗传转化及转化植株分子鉴定
[0054]
用含有pbrnsc过量表达载体的农杆菌,通过沾花法侵染col-0拟南芥(clough&bent,1998)。具体方法如下:
[0055]
1、用含有50mg/l k
+
和100mg/l r
+
的固体lb培养基划线活化农杆菌,在28℃的培养箱中培养36小时;
[0056]
2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆,放入100ml锥形瓶中,加入30ml含有50mg/l k
+
和100mg/l r
+
的液体lb培养基,在28℃的摇床中200rpm培养12小时;
[0057]
3、用50ml离心管5000rpm离心20分钟收集菌体;
[0058]
4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2ms;5%蔗糖(w/v);10μg/l 6-ba;用koh调ph到5.7;0.025%表面活性剂(v/v)】中;
[0059]
5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花;
[0060]
6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中,用真空抽滤泵抽真空到380mm汞柱,浸泡5分钟;
[0061]
7、放置在22℃的培养室中避光24小时,之后放在22℃、长日照(16小时光照
[0062]
/8小时黑暗)条件下培养。
[0063]
取潮霉素抗性两周大的拟南芥t1代阳性植株,取花序茎杆提取rna后,用荧光定量pcr检测pbrnsc表达量,引物为seq id no.5和seq id no.6。其中有3个株系(oe-1、oe-8、oe-14)存在较高的表达量,它们的纯合子用于后续实验。t3代纯合子种子与野生型种子经过消毒一起播到了发芽培养基【ms;3%蔗糖(w/v);0.75%琼脂(w/v)】上。种子发芽后将幼苗移到营养土中,放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。
[0064]
实施例7转基因植株木质素相关生理指标测定
[0065]
(1)转基因拟南芥木质素含量及单体含量的测定
[0066]
取野生型和t3代转基因系各5株,收集花序茎下部10cm长的茎,切成2mm长度,并混合样品烘干至恒重。取5mg干燥过后的样品提取cwr用于木质素分析,步骤如下:样品放在2ml离心管中,每步处理各30分钟,经过水(98℃)、乙醇(76℃)、氯仿(59℃)、丙酮(54℃),最后干燥至恒重。纤维素和木质素含量的测定参照实施例4。木质素组成成分用thioacidolysis法测定,方法参照(lapierre et al.,1995)。木质素经过thioacidolysis作用形成的派生物用三甲基硅烷衍生化后,用gc-ms检测。试验重复四次,每次都用相同量的样品。
[0067]
经测定转基因系花序茎中的纤维素和木质素含量显著上升(图3a-b);并且转基因系g型单体的含量显著上升,而s型单体的含量无显著差异(图3c)。
[0068]
(2)转基因拟南芥花序茎组织结构观察
[0069]
1组织切片染色
[0070]
取生长发育八周后的野生型及转基因拟南芥植物的花序茎底部1cm,用5%琼脂糖凝胶包埋,使用莱卡vt1000s振动切片机切出100μm厚度的切片。
[0071]
甲苯胺蓝染色:将切片置于0.3%甲苯胺蓝试剂中染色30s,用去离子水洗净后观察;
[0072]
wiesner染色:将切片置于wiesner试剂【37%hcl:3%间苯三酚酒精溶液=1:2(v:v)】中染色1min,用去离子水洗净后观察;
[0073]
染色:将切片置于0.5%高锰酸钾水溶液中2min,用去离子水洗净后加入3.7%hcl清洗两次,吸取上清后加入浓氨水1min后,直接取出制片观察。
[0074]
染色切片的观察使用尼康ni-u正置显微镜。
[0075]
2木质素自发荧光观察
[0076]
未染色的切片用尼康ti-e倒置荧光显微镜观察,二极管激光器发射355/25nm激光,不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
[0077]
3透射电镜
[0078]
与石蜡切片相同的样品用2.5%戊二醛固定液4℃固定12小时,取材后要迅速投入到新鲜的2.5%戊二醛固定液中;取材应在0-4℃低温下操作,取材的器械和固定液也要遇冷;由于固定液的渗透性较差,戊二醛渗透深度为0.5mm,锇酸的渗透深度为0.25mm,所以样品大小约为1.5mm
×
3mm,厚度不超过2mm;对于漂浮在固定液上面的材料,需要抽气使其完全浸渍于固定液下面,充分固定。方法参照(whitehill et al.,2016)。用imagej软件测量木质部细胞次生细胞壁的厚度。
[0079]
通过石蜡切片、木质素自发荧光检测、透射电镜检测发现,转基因拟南芥茎杆木质部细胞形态正常,但木质素显著积累、自发荧光较强,并且导管细胞和束间细胞次生细胞壁更厚(图3d-g)。
[0080]
(3)转基因拟南芥花序茎木质素合成相关基因相对表达量检测
[0081]
取野生型和转基因系4周大的植株初生花序茎,rna的提取、cdna的合成、荧光定量pcr的体系及步骤参照实施例2。过量表达pbrnsc拟南芥植株中,木质素合成基因atpal1、at4cl1、atc3h1、athct、atccomt1、atcomt、atf5h1、atccr1、atcad6、atlac17;纤维素合成基因atcesa4、atcesa7、atcesa8;半纤维素合成基因atirx8、atirx9;以及次生细胞壁合成转录调控因子atmyb46、atmyb63的表达水平都极显著上升(图3h-i),表明pbrnsc通过调控次生细胞壁合成相关基因的表达水平,引起茎杆中过度合成次生细胞壁。
[0082]
表2拟南芥实时荧光定量引物
[0083][0084]
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