【凝胶过滤法分离蛋白质实验报告】凝胶过滤法

作者：张馨予

篇一：实验四凝胶过滤法分离蛋白质

实验四凝胶过滤法分离蛋白质

课程名称：生物化学与分子生物学实验课年级：2005 专业、层次：临床医学本科授课教师：符伟玉职称：讲师学时：4学时基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求：

1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理。

2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作。

3、掌握凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别。

大体内容与时间安排：

1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理

2、凝胶过滤法的操作示范及注意事项

3、学生做实验

教学方法：讲授式+启发式

教学重点、难点：

重点：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理

2、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

3、实验操作中的装柱

难点：1、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

2、实验操作中的装柱

10min 10min 140min

一、实验原理

凝胶过滤又叫分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，待其与柱充分接触后随洗脱液往下渗，小分子蛋白质进入小孔内，因而在柱内停留的时间长，大分子蛋白质不能进入小孔径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入颗粒小孔，被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。高铁氰化钾【K3Fe(CN)6】分子量小，渗透到颗粒小孔的内部，洗脱时间长，后流出。这样就可以达到分级分离的目的。

在血红蛋白(Mw＝64 500)中加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。

…… …… 余下全文

篇二：凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质

实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质

一、实验目的

1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能

二、实验原理

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

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篇三：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤

实验报告

课程名称：生化实验B 实验日期：

班级：姓名学号：

血红蛋白凝胶过滤

一、背景及目的