专注于核酸现场快速检测

作者：张馨予

诊断研究 ERA扩增试剂盒支原体检测试剂盒荧光恒温扩增仪分子诊断用酶类样本处理
公共卫生呼吸道传染病原肠道传染病原虫媒传播病原血源及性传播病原
食品安全致病微生物肉源检测转基因农产品
水产畜牧鱼类病害虾类病害其它水产病害家畜疫病家禽疫病宠物疫病

科普 | 逆转录 PCR
先达基因 / 2020-09-21

逆转录是指以 RNA 为模板，合成与其互补的 cDNA 的过程。逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录（reverse transcription）和 cDNA 的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，故逆转录称为 RT-PCR 或反转录 PCR。逆转录 PCR 实验原理为：提取组织或细胞中的总 RNA，以 RNA 为模板，首先在利用逆转录酶反转录成 cDNA，再以 cDNA 链为模板进行 PCR 扩增，从而获得大量拷贝。逆转录 PCR 的出现使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。

逆转录 PCR 应用

逆转录 PCR 的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中 RNA 病毒的含量、合成 cDNA 探针、直接克隆特定基因的 cDNA 序列等。如在临床上 RT-PCR 可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的 RNA 病毒，如 HAV、HCR、HIV 等。在植物方面 RT-PCR 常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用 RT-PCR 检测分析 RNA 转录产物具有以下突出的优点：

l 理论上可以检测几乎任何基因的转录产物；

l 可以实现极为微量 RNA 样品（ng 级别）的检测；

l 样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测；

模板

逆转录 PCR 的模板是 RNA，可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA，都需确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。

RNA 提取

可以利用试剂盒从细胞（或组织）中提取得到 RNA。模板 RNA 的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响，从细胞中分离 RNA 应注意尽量减少 RNA 酶的污染（RNA 酶分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外环境中也存在大量 RNA 酶），在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境：避免 RNA 酶污染包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂抑制内源性 RNA 酶。

引物

用于反转录的引物有随机引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特异性引物三种，下表为三种引物的介绍：

引物

适用范围

随机引物

适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反随机引物转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应

Oligo-dT

适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA（原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA 和 tRNA 不具有PolyA 尾巴）

基因特异性引物

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况

专注于核酸现场快速检测

引物最好选择 Oligo-dT 或基因特异性引物，随机引物会从 RNA 的多个位点(包括核糖体 RNA)开始转录，特异性低。Oligo-dT 引物同大多数真核细胞 mRNA3'端的 poly(A)尾杂交，与使用随机引物相比特异性高。但是 Oligo-dT 引物对 RNA 样品的质量要求较高，对于从福尔马林固定的组织中提取的劣质 RNA 不适合用 Oligo-dT 引物。

逆转录酶

逆转录酶是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性

1. 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 的第一条链；

2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 杂合体中的 RNA;

3. 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一条 DNA 链为模板合成互补的双链 DNA