配伍对葛根琴连汤中葛根HPCE指纹图谱的影响

作者：杨超月

    葛根等连汤出自《伤寒论》，由葛根、黄岑、黄连、甘草组成，具有解肌、清热止痢功效，用于治疗太阳表邪内陷所致肠热下痢证，临床应用广泛。近年研究证明，葛根荃连汤具有解热、抗菌、抗病毒、解痉、抑制胃肠运动、抗缺氧、抗心律失常、增强机体免疫功能等药理作用。对该方的物质基础、作用机理及配伍组方研究成为该方研究的重点。笔者研究了配伍刘.葛根指纹图谱的影响。
1仪器与试药
1.1 仪器
    2700-HT型高效毛细管电泳仪(AppliedB iosystems公司，美国);毛细管:未涂层融硅毛细管，50um x 65 cm，有效长度43cm;HW-2000色谱工作站数据处理系统(南京千谱软件有限公司);Milipore-Q纯水器。
1.2 试药
    甲醇(色谱纯)、乙醇、磷酸氢二钠、硼砂均为国产分析纯;对照品:葛根素(中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号753-200007);葛根、黄菩、黄连、甘草药材由广东省药材公司提供，经本校中药鉴定教研室刘传明讲师鉴定，分别为豆科植物野葛Puerasia lobata Ohwi，唇形科植物黄芬干燥根茎&utellara b aicalemisG eorgi，毛蓑科植物黄连干燥根茎Coptic clunemis Franch，豆科植物甘草Clycyrrhiza uralemis Fisch干燥根茎(经蜜制)。
2 指纹图谱的建立
2.1供试样品的制备
    按处方配比(葛根15g，黄琴9g，黄连9g，甘草6g)取葛根菩连汤各味药饮片，加水400ml,浸泡15min，先煎葛根20min，余药共煎30min，煎2次，合并滤液，定容1000ML，取4uL，定量加甲醇6 mL，超声10 min，离心，定容10 rnL，作为供试样品。各配伍煎液同法制备。
2.2 电泳条件
    电解质溶液由30mmol/L磷酸盐、40m mol/L硼酸盐和甲醇组成;未涂层融硅毛细管(50um x 65cm，有效长度43cm)，分离电压22kV，进样1，;检测波长254 mn,温度30℃。
样品依次进样电泳.
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
    取全方供试品溶液1份，连续进样5次，测得主要峰相对迁移时间和单峰面积，结果表明葛根12个峰(命名为1一12)迁移时间相对恒定，6个峰(分别为4,6,8,9,10,12)峰面积相对恒定，RSD<5%.
2.3.2 稳定性试验
    取全方供试品溶液1份，分别在0,4,8,12,24 h进样，测得主要共有峰迁移时间和峰面积的色谱峰峰面积，表明葛根12个峰相对迁移时间稳定，6个峰的峰面积相对恒定，RSD<5%。
2.3.3 重现性试验
    按处方配比取全方药材饮片5份，按2.1项下煎煮，制成供试液，依次进样电泳，测得主要峰相对迁移时间和峰面积，结果表明葛根12个峰相对迁移时间稳定，6个峰的峰面积相对恒定，RSD<5%.
2.4指纹图谱技术参数
    根据10批葛根药材供试品溶液HPCE谱给出的相关参数，比较供试品谱图，其中葛根12个峰是各批供试品所共有的，因此确定12个峰为共有指纹峰，其中葛根6个峰峰面积相对恒定，RSD < 5 %，可以定量。其余各共有峰均按其相对迁移时间定性。
3 配伍对葛根琴连汤中葛根指纹图谱的影响
3.1 葛根菩连汤配伍组合正交设计
    选黄连、黄荃、甘草作为3个因素，选用药和不用药为两个水平，并考虑两两交互作用的Ig(f)正交表进行分组，因素、水平表见表10.
3.2 各配伍供试样品的制备及测定
    取配伍组合药材，按2.1项下制备，按2.2项下电泳条件测定。峰面积测定结果见表2。结果表明黄连、黄芬、甘草及其两两交互作用对葛根4,6,8,9,10,12峰的峰面积没有显著性差异。
3.3 统计处理采用SPSS10.0统计分析软件，方差分析。
4 结果分析与讨论
4.1样品制备方法的考察
    取样品离心后的沉淀物，用10WAL甲醇超声30 min，以甲醇为对照，在230-800nm扫描，各波长的紫外吸收均小于0.05，因此认为上述处理方法没有造成成分损失，方法可行。
4.2 葛根荃连汤中成分复杂，含有多种生物碱、黄酮类、皂昔类成分，单纯用磷酸盐电解质或硼酸盐电解质时分离效果不太好，采用磷酸盐、硼酸盐和甲醇混合电解质之后，对方中葛根的组分分离效果较好，经筛选采用本次实验条件。方法学考察表明该方法可以用于葛根琴连汤中葛根的指纹图谱研究，葛根有12个峰可以用相对保留时间定性，6个峰可以用峰面积定量。
4.3 含葛根的配伍煎液中葛根6个成分峰面积结果经统计分析(g7峰因与其他峰重叠，没有统计分析)表明，黄连、黄琴、甘草及其两两交互作用对其峰面积影响没有显著性差异，黄连、黄琴、甘草对葛根素(99)含量没有影响，这与用高效液相色谱法191测得的结果相一致。
4.4 在本实验条件下各配伍组合没有新的峰出现，即没有发现新的物质，葛根中12个峰也没有丢失。
4.5本法可为葛根荃连方及其他含葛根的方剂物质基础及配伍规律研究提供分析方法，亦可为葛根药材及其复方制订指纹图谱的建立提供参考。
4.6 研究主要针对配伍因素对方中葛根主要成分的影响，对于煎煮时间及制剂成型所采用的方法和手段对化学成分产生的影响有待进一步的研究。同时由于配伍中产生沉淀，因此在提取分离和制剂成型过程中也要加以注意。