浸染条蛋白质印迹法

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

浸染条蛋白质印迹法
【专利说明】浸染条蛋白质印迹法
相关串请的交叉引用
[0001]本申请要求2014年3月11日提交的名称为“浸染条蛋白质印迹法”的美国临时专利申请号61/951，148的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。
【背景技术】
[0002]电印迹法是一种在生物技术中广泛应用的技术。该技术涉及在其中分布有带电分析物(例如DNA、RNA或蛋白质)的基质上施加电势差。该电势差导致所述分析物迀移出该基质，沉积并固定在与该基质相邻的表面或“斑点”上。然后，通过用一种或多种可检测结合伴侣标记这些分析物，能以荧光、化学发光、反射性或其它现象对其进行检测。
[0003]电印迹法常与基于大小或电荷从基质中分离分析物的技术(例如电泳)相结合，并在该技术之后即刻进行。因此，电印迹法提供了基于与电泳相关特性呈正交或互补关系的特性来分析生物样品的一种途径。例如，可在聚丙烯酰胺凝胶中对蛋白质样品进行电泳，然后通过电印迹法将其转移到硝酸纤维素薄膜。蛋白质在凝胶中的迀移速率能反映出其分子量，而这些蛋白质与薄膜上结合伴侣的亲和性则能反映出这些蛋白质是否包含某些序列基序。由于电印迹法在电泳后进行且能保持通过电泳获得的分析物分离情况，在斑点上检测分析物能提供该分析物来源样品的多层次信息。
[0004]各种类型的电印迹法在本领域中是已知且实际应用的。当分析物是DNA片段时，将该分析物转移出凝胶或其它基质并转移到斑点内被称为“Southern印迹法”，这是根据其发明者英国生物学家Edwin M.Southern而命名的。类似地，RNA片段的转移被称为Northern印迹法，而蛋白质或多肽的转移被称为Western印迹法(即蛋白质印迹法)。其它的例子还包括用于翻译后修饰的“Eastern”印迹法，以及用于蛋白质相互作用的“FarWestern"印迹法。这些印迹技术中的一些可在不施加电势差的情况下进行，而是采用毛细管作用驱动分析物从基质转移到斑点中。
[0005]采用常规实施方法进行电印迹法需要经过复杂的过程。在基质中分离分析物后(例如通过电泳)，基质和斑点必须精确并置以易于分析物的转移。然后，必须在基质和斑点周围安装电极和其它设备。该设备可包含缓冲液储器、海绵或湿纸，从而使得电流能在电极间流动。随后，将电势差施加在电极之间，进行转移。然而，为了检测出分析物，必须先拆卸该设备，且必须将斑点从基质中取下并进一步处理。需通过该处理在受控模式下将斑点上的感兴趣分析物与结合伴侣接触。例如，在蛋白质印迹法中，可将斑点与如下物质一起孵育:非特异性结合该斑点的封闭蛋白、特异性结合感兴趣分析物的一抗、结合该一抗的带标记二抗。这些孵育都需要将斑点浸入不同的溶液。随后的检测可涉及将斑点紧邻薄膜放置或紧邻对结合伴侣之一上的标记物敏感的光学扫描仪放置。
[0006]电印迹法过程从多个层面上可说是代价昂贵。该过程耗时，在某些情况下可进行数日，且难以自动化。必须以数种不同的方式对斑点进行机械操作，而这些操作需要谨慎以确保例如基质和斑点不会破裂或斑点不会与污染物接触。因此，该过程需要高度熟练、受过全面训练的操作者才能成功执行。就所用试剂而言，电印迹法也非常昂贵。为了能以足够的灵敏度检测分析物，通常将斑点与大大过量的结合伴侣一起孵育，即便这些分析物可能仅占据斑点表面积的一小部分。
[0007]电印迹法有时不能提供可重现的或定量的数据。样品大小、转移效率以及结合伴侣对分析物的亲和性中存在的差异会导致检测不灵敏或不精确。两次电印迹过程对同一分析物的检测精度可能会有差异，分离步骤中由分析物产生的信号的差异可能并不能反映分析物的丰度差异或完整性差异。类似的，在同一过程中由两种不同分析物产生的信号可能并不能精确反映这些分析物的相对浓度。此外，许多电印迹法过程仅能检测样品中所存在的一小组分析物，且不能在基质上检测分析物。因此，在将分析物从基质转移到斑点上时，样品组成信息(例如蛋白质分子量分布)可能丢失。

【发明内容】

[0008]本文提供了采用浸染条分离、固定和/或检测一个或多个样品中的分析物的方法、试剂盒和系统。还提供了用于本发明实施方式中的浸染条。
[0009]提供了一种分离和检测样品中分析物的方法。所述方法包括:
将样品施加于分离介质(separat1n medium);沿分离轴在所述分离介质中分离样品中的分析物；将所述分析物固定在埋设(embedded)于所述分离介质中的浸染条上；从所述分离介质取出所述浸染条；检测固定在该取出的浸染条上的分析物。
[0010]在本发明方法的一些实施方式中，对样品中分析物的分离包括进行电泳、电渗或等电点聚焦。所述分离介质可包含在平板、管、盒、玻片、毛细结构物(例如毛细管)、梳状物、微型卡、开放模具或微流芯片样形式中的凝胶。或者或此外，分离介质可包括聚合物基质、水凝胶或交联聚合物，例如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-二-丙烯酰胺或N，N-聚二甲基丙烯酰胺。分离介质还可包含变性剂。在一些实施方式中，所述分离介质包含色谱树脂，且分离样品中的分析物包括使所述样品流过所述色谱树脂。在一些实施方式中，所述分离介质包含流体通道，且分离样品中的分析物包括使所述样品流过所述流体通道。
[0011]在本发明的一些方面中，将分析物固定在所述浸染条上包括使分析物共价连接于所述浸染条。这可包括将分析物与所述浸染条交联。在其它方面中，将分析物固定在所述浸染条上包括使分析物非共价连接于所述浸染条。这可包括将分析物与亲和结构物连接。该亲和结构物可包括抗体、酶、蛋白质、肽、适体、配体、核酸、核苷酸、核酸类似物、配位复合物、天然或合成聚合物、碳水化合物或小分子。在一些情况下，分析物是蛋白质，所述亲和结构物包括抗体。或者或此外，将分析物固定在浸染条上可包括将分析物沉积在与浸染条偶联的膜上。所述膜可包括硝基纤维素或聚偏氟乙烯。
[0012]在本发明方法的一些实施方式中，分析物通过吸附、静电相互作用、离子相互作用或疏水相互作用固定在浸染条上。在一些实施方式中，将分析物固定在浸染条上包括将该浸染条暴露于光、热或改变的化学环境下。在一些实施方式中，将分析物固定在浸染条上包括让该浸染条接触固定试剂。可将分析物非特异性地固定在浸染条上。在一些实施方式中，浸染条包含电极，且将分析物固定在该浸染条上可包括向该电极供电。浸染条还可包含磁体，且将分析物固定在该浸染条上可包括向该磁体牵引分析物连接的磁性标记物。
[0013]在本发明的方法中，在一些实施方式中，检测固定在取出的浸染条上的分析物可选择光学检测该分析物或与该分析物连接的标记物。在一些实施方式中，检测包括使取出的浸染条与针对样品中一种或多种分析物的结合伴侣接触，并检测指示该结合伴侣与所述一种或多种分析物之间结合的信号。结合伴侣可包括抗体、酶、蛋白质、肽、适体、配体、核酸、核苷酸、核酸类似物、配位复合物、天然或合成聚合物、碳水化合物或小分子。在一些情况下，所述分析物是蛋白质，所述结合伴侣包括抗体。所述信号可包括化学发光、电发光、荧光、红外辐射、放射性、颜色或光吸收，且可由表面等离子体共振引起。在一些实施方式中，检测信号包括使结合伴侣接触与其结合或与其反应的试剂。在本发明方法的一些实施方式中，检测取出的浸染条上的分析物包括，作为替代或补充，向该浸染条施加封闭剂。
[0014]本发明的方法还可包括其他步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括将浸染条埋于分离介质中。这可在分离分析物之前或之后进行。将浸染条埋于分离介质中可包括对该分离介质进行穿孔、切割或切削。在一些实施方式中，所述方法还包括将对照分析物沉积在浸染条上，然后将浸染条埋于分离介质中。
[0015]在一些实施方式中，将分离介质保持在支持结构物上，且所述方法还包括在该支持结构物中移动浸染条，然后将分析物固定在该浸染条上。可沿与分离轴垂直的方向移动浸染条。或者或此外，该方法可包括将对照分析物施加于分离介质，在分离介质中沿分离轴分离对照分析物。在一些实施方式中，该方法还包括使分析物变性或从取出的浸染条中洗脱一种或多种分析物。
[0016]在本发明方法的实施方式中，浸染条可具有不同的特性。浸染条可以是长形的(elongated)并与分离轴平行或垂直排列。浸染条可为多孔性。浸染条可包含纹理或串珠状涂层，其可增大该浸染条的表面积。或者或另外，浸染条可有珠饰。浸染条可包括玻璃、塑料、陶瓷、金属、碳纤维、石墨或共聚物，且可成形为杆、片叶、片(sheet)、丝、针或线。在本发明方法的一些实施方式中，浸染条导电或导热。在一些实施方式中，浸染条绝缘或绝热。
[0017]在一些实施方式中，浸染条包含捕获剂。例如，捕获剂可为交联剂或亲和结构物。该亲和结构物可包括抗体、酶、蛋白质、肽、适体、配体、核酸、核苷酸、核酸类似物、配位复合物、天然或合成聚合物、碳水化合物或小分子。或者或另外，捕获剂可为膜在一些实施方式中，所述膜包括硝基纤维素或聚偏氟乙烯。
[0018]在一些实施方式中，浸染条还可具有柄部(handle port1n)。柄部可印有记号，以便于识别固定在浸染条上的分析物或样品。在本发明方法的一些实施方式中，分离介质装于支持结构物中，所述支持结构物包含浸染条。
[0019]本发明中还提供了分离和检测多个样品中分析物的另一种方法。所述方法包括:将多个样品施加于分离介质；沿分离轴在所述分离介质中分离样品中的分析物；将所述分析物固定在埋于所述分离介质中的多个浸染条上，其中各样品与至少一个浸染条关联；从所述分离介质取出所述浸染条；检测在该取出的浸染条上的分析物。
[0020]在该方法的一些实施方式中，将多个浸染条中的两个构设为固定不同的分析物。这两个浸染条可与同一样品相关联。在一些实施方式中，分离介质是平板凝胶，各浸染条与平板凝胶的一个泳道对齐。
[0021]在本发明所提供的其它方法中，可分离和检测多个样品中的分析物。所述方法包括:将多个样品施加于分离介质；沿分离轴在所述分离介质中分离样品中的分析物；将所述分析物固定在埋于所述分离介质中的浸染条上，其中该浸染条包含多个捕获区，各样品中的分析物被固定在分离的捕获区上；从所述分离介质取出所述浸染条；检测在该取出的浸染条上的分析物。
[0022]在该方法的一些实施方式中，浸染条还具有纵轴和侧面(lateral surface);该浸染条的纵轴与分离轴对齐；浸染条的捕获区阵列于侧面上。在此，浸染条可为圆柱形。捕获区可包括侧面内的凹痕或从侧面凸起的肋状物。
[0023]本申请还提供了用于分离和固定样品中分析物的试剂盒。一个此类试剂盒包括分离介质和浸染条。分离介质构设为用于分离施加于其上的样品中的分析物。浸染条构设为能埋入分离介质且此后能从该分离介质中取出。浸染条还构设为用于在其埋于分离介质中时固定分离介质中分离的分析物。
[0024]另一种试剂盒包含分离介质和埋设于分离介质中的浸染条。分离介质构置为用于分离施加于其上的样品中的分析物。浸染条设置为用于固定分离介质中分离的分析物。浸染条还构置为能从分离介质中取出。
[0025]在一些实施方式中，这些试剂盒还包含装有分离介质或构设为用于装盛分离介质的支持结构物。试剂盒还可包括用于检测固定在浸染条上的分析物的试剂或缓冲剂。
[0026]本发明中提供的另一种试剂盒包含分离介质和装有分离介质的支持结构物。分离介质构置为用于分离施加于其上的样品中的分析物。支持结构物包括凸入分离介质的肋状物，这些肋状物构置为用于固定分离介质中分离的分析物。支持结构物还构置为能打开并从分离介质中取出。
[0027]本发明中还提供了一种用于分离和检测分析物的系统。该系统包括:分离介质；用于将一个或多个浸染条保留在分离介质中的支架；检测介质；以及与所述支架连接的马达，其中该马达构设为用于从分离介质中取出所述一个或多个浸染条并使所述一个或多个取出的浸染条接触所述检测介质。
[0028]在一些实施方式中，所述系统还包括用于将分析物固定到所述一个或多个浸染条上的刺激机制。或者或此外，该系统可包括检测器，所述检测器设置为用于检测取出的已接触过检测介质的一个或多个浸染条上所固定的分析物。在本发明系统的一些实施方式中，马达还设置为将一个或多个浸染条埋入分离介质。
[0029]本发明中还提供了用于固定样品中分析物的浸染条。浸染条包括长形部分、位于该长形部分上的捕获剂以及柄部，其中所述长形部分能被埋入分离介质，所述柄部用于所述浸染条的机械操持。
[0030]浸染条的实施方式可具有不同特性和性质。长形部分可包含电极或磁体，增大浸染条表面积的纹理，或玻璃、塑料、陶瓷、金属、碳纤维、石墨或聚合物。长形部分可为多孔、珠饰的、或成形为杆、片叶、片、丝、针或线。在一些实施方式中，浸染条导电或导热。在一些实施方式中，浸染条绝缘或绝热。浸染条的捕获剂可为例如交联剂或亲和结构物。该亲和结构物可包括抗体、酶、蛋白质、肽、适体、配体、核酸、核苷酸、核酸类似物、配位复合物、天然或合成聚合物、碳水化合物或小分子。捕获剂还可为膜，其可包括硝酸纤维素或聚偏氟乙稀。
[0031]在一些实施方式中，浸染条包含位于长形区物理分离的多个局部上的多个/种捕获剂。在一些实施方式中，柄部包括印有记号，以便于识别固定在浸染条上的分析物或样品。所印的记号可包括文本、条形码或符号。
[0032]本发明中还提供了用于固定多个样品中分析物的另一种浸染条。该浸染条包括长形部分，该部分包含多个捕获区、多种捕获剂和柄部。捕获区构置为各自有至少一种捕获剂，