离子交换层析介质

作者：张馨予

离子交换层析是生物大分子分离纯化最常用的方法。以琼脂糖凝胶为基质的离子交换层析介质保留了天然多糖化合物极好的亲水性及孔结构，对生物活性大分子具有很好的相容性，特别适用于蛋白质、酶、多糖、核酸、质粒等的分离纯化。离子交换层析介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以-(CH2)2N(C2H5)2、-CH3N(CH3)3、-CH2COO-、-SO3-为配基，具有很好的化学和物理稳定性。

2. 产品特性

离子交换层析介质的理化性质和产品特性如表1所示。

表1 离子交换疏水层析介质的理化性质和产品特性

参数

指标

基质

6%交联琼脂糖凝胶

功能基及交换容量

DEAE

0.11-0.16 mmol/ml wet gel

0.18-0.25 mmol/ml wet gel

0.09-0.13 mmol/ml wet gel

0.18-0.25 mmol/ml wet gel

动态载量

DEAE

110 mg HSA/ml wet gel

120 mg HSA/ml wet gel

50 mg RNase/ml wet gel

70 mg RNase/ml wet gel

形状

球形

介质平均粒径

90 μm (45-165)

最高流速（25℃）

750 cm/h

推荐流速

<150 cm/h

最高耐压

0.3 MPa (3 bar)

pH稳定性

3-13（长时间）；2-14（短时间）

化学稳定性

室温下1 M NaOH、0.01 M HCl、6 M盐酸胍、

8 M脲浸泡7天，性能无明显变化

物理稳定性

溶液的pH或离子强度影响介质的体积变化率<2%

保存

4-30 oC（20%乙醇）

3. 应用

离子交换介质广泛用于蛋白质、酶、多糖、核酸、质粒等的分离纯化。层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。具体的操作方法如下（以20 cm 1.6 cm I.D., H=7.5 cm, CV=15 ml为例）：

平衡：用5~10CV的平衡缓冲液（Buffer A，如20 mM PB, pH7.0，具体的缓冲体系应根据目标蛋白的稳定性和等电点、离子交换介质的种类进行筛选和优化）以2-5ml/min的流速平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。

　　进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析或添加相应量的盐；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45 μm）处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

　　淋洗：以2-5 ml/min的流速上样，并继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM PB+1 M NaCl, pH7.0，也可采用pH梯度洗脱）以2-5ml/min的流速洗脱（可采用线性梯度洗脱或阶越梯度洗脱），收集流出液。

再生：每次层析之后可用1-2 M NaCl清洗层析柱，除去强结合的蛋白。

　　原位清洗：介质使用数次（具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，需要对介质进行在位清洗：

（1）对于通过离子键强结合的蛋白，可用2 M NaCl以1-2 ml/min的流速反向清洗10-15 min；

（2）对沉淀蛋白、疏水性结合的蛋白、脂蛋白，可用1 M NaOH以1-2 ml/min的流速反向冲洗3-4 CV；