技术连载:基因编辑细胞系构建FAQ



基因敲除细胞系构建  FAQ 目录
1. 基因敲除的 sgRNA 如何设计?
2. 如何避免脱靶效应?
3. 如何检测脱靶?
4. CRISPR-Cas9 系统的活性检测方法有哪些?
5. 实现基因 loss of function,我是要做敲低(RNAi)还是敲除?
6. 实现 KO 的主要技术手段、技术原理和技术特点是什么?
7. KO 的策略有哪些?我们的优势是什么?
8. 移码突变和片段敲除哪个能更好的破坏目的蛋白的功能结构域?
9. 如何选择最有效的细胞转染法?
10. KO 单克隆与 KO cell pool 的区别?
11. 构建好敲除细胞系之后,如何进行验证?
12. 筛选出了很多单克隆杂合子,但无法筛选出纯合子?
13. 是否可以确保蛋白不表达?
14. 细胞 KO 的整体流程是?周期大概是多久?
15. KO 细胞有哪些应用
16. 如何实现特定片段的精确敲除?
17. 除 Cas9 外,CRISPR 技术还有哪些常用核酸酶?有什么区别?
18. 基因拷贝数对敲除的影响
19. 如何确定敲除某个基因会引发细胞死亡或严重影响细胞状态?
20. 非编码 RNA(lncRNA 与 miRNA)与编码基因的敲除策略有什么差异?
21. 如何利用 CRISPR 基因编辑技术做靶基因筛选工作?


1. 基因敲除的 sgRNA 如何设计?

在 CRISPR-Cas9 系统中,sgRNA(small guide RNA,sgRNA)通过碱基互补配对原则引导 Cas9 蛋白酶至基因组特定的靶序列上,Cas9 蛋白与 PAM 序列结合后便可对靶位点进行切割,形成 DNA 双链切口。sgRNA 设计的合理与否,对于 CRISPR-Cas9 编辑系统的切割效率,甚至最后能否得到 KO 细胞具有重要影响。目前虽然有诸多高效快速的 gRNA 设计工具,但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA 的设计需要遵循以下原则:

(1) 不影响其他基因,尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域,且能影 响蛋白的功能结构域。

(2) 尽可能影响所有的转录本,敲除位点最好在编码区的前 50%,但避免敲除 ATG 所在外显子或 ATG 之 前的外显子。

(3) 片段敲除的 sgRNA 设计在内含子上,这样能敲除整个外显子区,避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后 序列尽量简单,方便后续的 PCR 鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非 3 的倍数,使靶区域后面 的序列发生移码。另外,片段敲除所选定的敲除区域不要超过 10 Kb,超过 10 Kb 后编辑敲除效率会降低。

(4) 在设计 sgRNA 时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC 含量、潜在的脱靶位点等信息。 例如靶点的 GC%尽量不要低于 40%,靶点序列 GC%偏高(50%~70%)有较高的打靶效率;靶点内不 要有连续 4 个以上的 T 碱基,避免形成 RNA Pol III 的转录终止信号等。

2. 如何避免脱靶效应?

研究表明,sgRNA 通常会与基因组 DNA 发生一定概率的序列错配,从而引起非预期的基因组编辑,即 所谓的脱靶效应(Off-target effects)。为了尽可能避免脱靶效应,可以通过以下几点进行优化:

(1) 提高 sgRNA 特异性。在设计 sgRNA 序列时,可选择 GC 含量在 50%~70%,与靶基因序列之外的基因组 DNA 同源性较低的 sgRNA 序列,同时还可以选择在 sgRNA 的 5’端增加 2 个鸟嘌呤,来提高 sgRNA 的特异性。

(2) 控制 Cas9-sgRNA 用量。通过控制 Cas9 蛋白或 sgRNA 的表达量来减少脱靶效应,细胞中持续表达 Cas9 将增加脱靶风险,因此可以通过 Cas9 蛋白的抑制剂来降低 Cas9 活性,降低脱靶效应。尽管通过调节 sgRNA 和 Cas9 浓度可降低脱靶风险,但浓度降低后,相应的基因组编辑能力也会减弱,要根据实际情 况选择合适的 gRNA 和 Cas9 复合物比值。

(3) 改造 Cas9。通过对野生型 Cas9 进行改造提高 CRISPR-Cas9 系统的特异性,可将 Cas9 中的一个酶切位 点失活,得到突变型切口酶,由于突变型 Cas9 只能对单链进行切割,因此需要 2 条 sgRNA 同时引导, 在 DNA 不同的链产生 2 个相近的切口,才能引起双链 DNA 断裂。只有 2 条 sgRNA 均发生错配时才会 发生脱靶,这极大降低了脱靶效应。 

(4) 选择合适的递送载体。目前 Cas9 可以通过 DNA 质粒、病毒和蛋白质三种方式传递到靶细胞中,利用 Cas9/sgRNA 核糖核蛋白(ribonucleoproteins,RNPs)递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源 DNA 序列,可有效减少脱靶效应。

3. 如何检测脱靶?

一直以来,CRISPR 系统的脱靶效应尚未得到有效的解决,因此对于脱靶效率的检测也有不少研究。

针对细胞外的检测方法有:

(1) Digenome-seqDigested genome sequencing,通过 Cas9 核酸酶体外切割后提基因组 DNA,进行高通量测 序,鉴定脱位点,生物信息学分析来检测脱靶情况。




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