尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得

作者：张馨予

1.本发明涉及渔业育种养殖方法，具体涉及尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系。

背景技术：

2.杂交和选育是鱼类育种的主要方式。但由于种间生殖隔离的存在，远缘杂交难以形成可育品系。并且由于缺乏可供参考和借鉴的遗传和繁殖规律,很难预判远缘杂交后代可能会出现的后代类型。如果光凭表型优势互补进行有盲目性质的育种，容易导致杂交后代死亡、没有杂交优势、难以形成品系等不良结果。因此，杂交育种虽作为鱼类最常规的育种方式仍具有较多局限性。
3.基因编辑育种是近年兴起的对具有农业生产意义的动物、植物以及微生物进行关键基因修饰以达到增产的育种技术。这种育种技术具有明确的目的性，例如“抗冻”、“抗逆”、“瘦肉率高”等。并且基因编辑育种的落脚点在单个基因或者某几个基因，这些基因功能的缺失往往对育性没有影响，避免了传统杂交育种存在的“生殖隔离”问题。研究者使用zfn基因编辑技术成功获得β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，blg)基因敲除奶牛，突变体所产牛奶因缺乏β-乳球蛋白过敏原可减少幼儿乳过敏症的发生。2017年新疆畜牧科学院刘明军课题组使用crispr/cas 9基因编辑技术生产出彩色的绵羊。在鱼类中，西南大学王德寿研究团队通过外源激素诱导以及基因编辑技术成功建立尼罗罗非鱼全雄鱼养殖体系。对草鱼连接黏附分子gcjam-a的dna序列进行靶向敲除能减少其对草鱼呼肠孤病毒(gcrv)的感染等。总体来说，基因编辑育种在鱼类中的应用较少且不够深入，这主要受养殖鱼类繁殖周期长的制约。
4.肌肉生成抑制素(myostatin，mstn)，又称生长分化因子8(growth differentiation factor 8，gdf-8)，属于tgf-β超家族成员，该基因对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。在哺乳动物中大量研究表明，mstn基因敲降或敲除能引起骨骼肌质量增加。如mstn基因敲除小鼠骨骼肌纤维数量达到野生型的2-3倍，具备明显的“双肌表型”；对牛mstn基因进行敲除同样能导致骨骼肌健硕的“双肌牛”的出现。在鱼类中，研究者对模式生物斑马鱼及青鳉的mstn基因敲除发现鱼体体型增大、肌肉含量显著增加；养殖鱼类中，研究者对淡水鱼类黄颡鱼以及海水鱼类红海鲷的mstn基因分别进行敲除，发现突变鱼均具有明显的双肌表型，且七月龄mstn基因敲除黄颡鱼的体重是野生鱼的128.19％；mstn基因敲除红海鲷的可食用部分相较于野生型增加16％。而关于mstn基因在其它养殖鱼类中的研究鲜见报道，mstn基因是否在养殖鱼类中具有保守功能还需要更为详实的实验数据加以佐证。
5.尼罗罗非鱼作为世界性养殖鱼类，具有生长快、繁殖周期短、抗病及适应性强等特点，养殖地区遍布80多个国家和地区。据“中国水产养殖网”统计，全球罗非鱼产量在2020年达到近650万吨，并有望在2022年突破750万吨，其中亚洲产量占比维持在60％左右。中国罗
非鱼养殖起于上世纪60年代，90年代飞速发展，养殖产量稳居世界首位。从1961年的0.35万吨增加到2019年的164.17万吨，年均增长率为11.19％。除此之外，罗非鱼肉厚刺少，富含多不饱和脂肪酸，有“21世纪之鱼”之称，正逐渐成为传统白肉鱼种的替代品种，受到各国市场的亲睐。
6.尚没有尼罗罗非鱼mstn基因敲除获得纯合突变系的报道。

技术实现要素：

7.有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立方法及以此获得的快速生长品系，该方法基于crispr/cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中对肌肉生成抑制素(myostatin)基因进行敲除，得到了肌肉含量多、生长速度快的“双肌罗非鱼”纯合突变系。
8.本发明提供的尼罗罗非鱼crispr/cas9基因编辑的方法，包括步骤：
9.(1)将目的基因grna与cas9 mrna混合，并室温孵育获得grna与cas9 mrna的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀得到crispr/cas9基因编辑的显微注射液；
10.(2)将尼罗罗非鱼一细胞期受精卵转移至显微注射台使受精卵均匀平躺；
11.(3)将所述显微注射液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至所述步骤(2)固定的受精卵中,
12.(4)注射后将受精卵转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化。
13.本发明还提供尼罗罗非鱼mstn基因的crispr/cas9基因编辑方法，包括步骤：
14.(1)将尼罗罗非鱼mstn基因grna与cas9 mrna混合，并室温孵育获得grna与cas9 mrna的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得crispr/cas9基因编辑的显微注射液，其中，mstn基因grna终浓度为400-600ng/μl；所述cas9 mrna的终浓度为400-600ng/μl；
15.(2)使人工授精后一细胞期尼罗罗非鱼受精卵均匀平躺于培养皿中；
16.(3)将所述显微注射液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至所述步骤(2)固定的细胞受精卵中,
17.(4)注射后将受精卵转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化。
18.进一步，所述mstn基因grna制备方法为：针对crispr/cas9基因编辑的mstn基因靶位点设计grna特异性f引物，以grna质粒为模板用所述f引物和通用r引物进行扩增并回收片段得到grna dna模板，将所述grna dna模板体外转录后获得mstn基因的grna；所述cas9mrna制备方法为：将cas9质粒线性化之后体外转录制备而成。
19.进一步，所述crispr/cas9基因编辑的靶位点为seq id no:1所示核酸序列；针对seq id no:1所示靶位点设计的grna特异性f引物序列如seq id no:2所示。
20.进一步，所述通用引物序列如seq id no:3所示。
21.进一步，所述显微注射液中mstn基因grna终浓度为500ng/μl；所述cas9 mrna的终浓度为500ng/μl；所述显微注射的体积为每个受精卵0.005μl。
22.本发明还提供上述方法基因编辑后阳性鱼突变筛选方法，所述方法包括：
23.a.提取基因组dna并以基因组dna为模板以设计的检测引物进行pcr扩增并回收产物；
24.b.利用hpyav限制内切酶对回收产物进行酶切检测,可切开的序列为未突变，切不开的序列则为获得mstn基因缺失突变；
25.c.所述阳性鱼为嵌合体，其序列只能被部分切开的筛选为突变阳性；
26.所述检测f引物为：如seq id no:4所示；
27.r引物为：如seq id no:5所示。
28.本发明还提供通过上述阳性鱼突变筛选方法获得尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的方法，所述方法包括:
29.(1)将3月龄筛选得到的阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代；
30.(2)待雄鱼性成熟，将其与野生型雌鱼交配，从不同突变类型的f1代鱼中选取突变类型相同且碱基非3的倍数缺失的雌雄罗非鱼作为f1代亲鱼；
31.(3)待f1代亲鱼性成熟，两者交配可得到含有纯合缺失mstnb的f2代尼罗罗非鱼。
32.进一步，所述纯合缺失mstnb的f2代尼罗罗非鱼鉴定方法为：
33.i.提取f2代鱼基因组dna，以基因组dna为模板，利用page引物扩增并将扩增产物进行page，后经凝胶成像系统成像；
[0034]ⅱ.通过条带显示判断：当扩增产物为一条带时，为野生型或纯合子；当扩增产物为四条带时，为杂合子；
[0035]ⅲ.从野生型与纯合子中通过所述突变筛选方法得到尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系，并通过测序确认检测结果；
[0036]
所述page f引物为：如seq id no:6所示；
[0037]
所述pagef r引物为：如seq id no:7所示。
[0038]
本发明还提供通过上述方法获得的尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除快速生长品系。
[0039]
本发明的有益效果在于：
[0040]
1.本发明获得的mstnb突变尼罗罗非鱼在七月龄较野生型体重增长50％左右，为提高尼罗罗非鱼养殖产量提供重要支撑，具有良好的应用前景。
[0041]
2.本发明首次在尼罗罗非鱼中通过crispr/cas9基因编辑技术成功建立了mstnb纯合敲除系，为鱼类乃至脊椎动物研究肌肉生长发育和机体生长调控提供了一个基因功能缺失平台。有助于进一步认识mstn基因作用机制以及生长负调控作用的意义。
附图说明
[0042]
图1 mstnb基因敲除建系：
[0043]
1a.mstnb靶位点设计在第一个外显子上，含有酶切位点hpyav。1b.mstnb基因敲除f0代酶切检查图谱。1c.f2代mstnb基因靶位点测序。1d.f2代mstnb基因(含靶位点)page电泳。1e.mstnb基因敲除建系流程。
[0044]
图2五月龄mstnb-/-罗非鱼(纯合突变体)鱼形态及生长特征鉴定：
[0045]
2a.外型观察；2b.体重(body weight)；2c.体长(body length)；2d.体高(body height)；2e.体宽(body width)，*表示显著性差异(p《0.05)。
[0046]
图3七月龄mstnb-/-罗非鱼(纯合突变体)肌肉组织学鉴定：
[0047]
3a.单位面积肌纤维定量研究示意图；3b.mstnb+/+和mstnb-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部横截面；3c.mstnb+/+和mstnb-/-罗非鱼躯干头部肌纤维h&e染色；3d.mstnb+/+
和mstnb-/-罗非鱼躯干头部、中部、尾部横截面面积定量比较。3e.mstnb+/+和mstnb-/-罗非鱼骨骼肌单位面积肌纤维数量；3f.mstnb+/+和mstnb-/-罗非鱼骨骼肌单位面积肌纤维尺寸。cephalosome，躯干头部；trunk,躯干中部；rump,躯干尾部。*表示显著性差异(p《0.05)，**表示显著性差异(p《0.01)。
具体实施方式
[0048]
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
[0049]
本发明基于crispr/cas9基因编辑技术在尼罗罗非鱼中对肌肉生成抑制素(myostatin)基因进行敲除，以得到肌肉含量多、生长速度快的尼罗罗非鱼新品系。具体步骤如下：
[0050]
实施例1：利用crispr/cas9基因编辑技术对尼罗罗非鱼mstnb基因进行有效打靶
[0051]
1、靶点设计
[0052]
在zifit()上进行靶位点设计，设计原则及步骤见李明辉论文(罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用，李明辉，2014)grna引物序列为(seq id no:2)：5
’‑
taatacgactcactatagcagccttccgtcagcaccgttttagagctagaaatagc-3’。下划线序列为靶位点(seq id no:1)，5’端为t7启动子序列，3’端为grna模板质粒结合序列。引物由华大基因合成。
[0053]
2、grna和cas9合成及显微注射
[0054]
2.1 grna合成
[0055]
1)以grna质粒为模板(质粒信息见chang et al.,2013)，用设计好的f引物(seq id no:2)和通用r引物进行扩增并回收片段。(r引物序列：agcaccgactcggtgccac(seq id no:3))体系如下：
[0056][0057]
反应条件：退火温度60℃；延伸时间10s
[0058]
2)体外转录
[0059]
以t7 rna polymerase进行体外转录，体系如下：
[0060][0061]
混匀后，37℃水浴2h。加入2μl的dnase i，37℃水浴15分钟。加入50μl无水乙醇和2μl醋酸钠，混匀，-80℃过夜。4℃，12000rpm离心25分钟，弃上清；70％无水乙醇洗2次；空离5分钟，吸去多余酒精，超净吹干并加入适量无酶水；测浓度，电泳检测，-80℃保存。
[0062]
2.2 cas9 mrna合成
[0063]
1)质粒线性化：质粒信息见(chang et al.,2013)，线性化体系如下：
[0064][0065]
线性化条件：37℃水浴，3h。
[0066]
2)切胶回收(胶浓度：1％)；
[0067]
3)体外转录；
[0068]
以上步回收产物为模板进行体外转录，体系如下：
[0069][0070]
2.3显微注射
[0071]
将grna及cas 9mrna稀释至1000ng/μl。按照1:1比例各1μl进行混合，并加入约0.4μl酚红溶液(起指示作用)。将混合液转至微型针管中并利用显微注射仪将其注射至1细胞-4细胞受精卵中,同时单独注射grna和cas9 mrna做阴性对照。注射完成后，将其转入28℃恒温循环水孵化系统中进行孵化。
[0072]
3、f0代阳性鱼的突变筛选
[0073]
3.1突变检测引物设计
[0074]
检测引物参照靶位点，f引物设计在离靶点上游80bp左右处(考虑到后续测序误差，故f引物离靶点较远)，r引物设计在靶点下游。page引物长度控制在70-110bp间，包含靶位点。引物在ncbi primer blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行设计并检测其特异性。检测及page引物如下：
[0075]
检测引物：
[0076]
mstnb-j-f：5
’‑
gcttgctgattgcgttgg-3’(seq id no:4)
[0077]
mstnb-j-r：5
’‑
aaggagcggattcgtatgtg-3’(seq id no:5)
[0078]
page引物：
[0079]
mstnb-page-f：5
’‑
gcgttgggtccagtagttct-3’(seq id no:6)
[0080]
mstnb-page-r：5
’‑
tagcgcattgatccgtgtct-3’(seq id no:7)
[0081]
3.2 f0检测：
[0082]
孵化后第三天收集收集注射后的鱼卵采用酚-氯仿-异戊醇抽提法提取基因组dna，具体步骤参考陈锦霖博士毕业论文(翻译延伸因子eef1a1b和42sp50在罗非鱼配子发生中的功能研究，陈锦霖,2014)。并以此为模板，用预先设计好的检测引物进行pcr扩增并回收产物，利用hpyav限制内切酶(序列未突变即可切开，序列突变则切不开)进行酶切检测。体系如下：
[0083][0084]
条件：37℃水浴，3h。
[0085]
酶切完进行琼脂糖凝胶电泳(胶浓度，1.5％；时间，20min)。
[0086]
由于序列改变，突变后的片段切不开，而未突变的序列则被切开。阳性鱼为嵌合体，故其序列一部分能切开而另一部分不能被切开。确定grna、cas9工作之后，进行批量注射，在3月龄进行同样的酶切检测，并将阳性鱼养殖于室内循环水系统中至成年以传代。
[0087]
实施例2：基于f0代阳性鱼的传代建系
[0088]
1、获得杂合子mstnb突变f1代；
[0089]
待雄鱼性成熟(6月龄左右)，将其与野生型雌鱼交配，从而得到不同突变类型的f1代鱼，通过检测引物扩增结合测序技术对突变类型进行鉴定，选取突变类型相同(且碱基非3的倍数缺失)的雌雄罗非鱼作为f1代亲鱼。待f1代亲鱼性成熟，两者交配即可得到含有纯合缺失的f2代鱼。
[0090]
2、获得纯合子mstnb突变f2代
[0091]
纯合突变采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)结合测序技术进行检测。首先提取f2代鱼基因组dna，以此为模板利用page引物扩增并将扩增产物进行page，后经凝胶成像系统成像。通过条带显示判断野生型(一条带)、杂合子(4条带)以及纯合子(1条带)。并将检测出的纯合鱼送测序(步骤与上面3.f0代阳性鱼的突变筛选相同)以确认检测结果。
[0092]
3、本发明尼罗罗非鱼mstnb纯合敲除系的建立
[0093]
依托于crispr/cas9基因编辑技术以及显微注射技术，本发明成功获得mstnb基因突变f0代阳性鱼。敲除靶位点设计在第一个外显子上，序列为：“gcagccttccgtcagcacc”，含hpyav酶切位点(图1a)。f0代基因组酶切显示，在grna和cas9 mrna双注射的泳道，有未被切开的条带，表明在f0代基因组水平出现阳性突变(图1b)。将阳性雄鱼作为父本，以野生型雌鱼为母本，通过杂交得到f1代。筛选f1代突变类型相同雌雄鱼并将其作为父母本进而杂交得到f2代(图1e)。纯合子通过sanger测序及聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,page)进行鉴定(图1c,d)。测序峰图比较发现纯合子靶点处缺失4bp(agcc)，page结果显示：野生型只有一条带；杂合子含有四条带：位于上方的两条异源双链、位于下方的一条野生型带和一条突变带；纯合子只有一条突变带。综上所述，本发明在尼罗罗非鱼中成功地建立了mstnb纯合突变系。
[0094]
实施例3基于mstnb纯合突变鱼的表型鉴定及肌肉组织学观察
[0095]
评估方法：
[0096]
1、生长性能评估
[0097]
1.1体重(body weight)；
[0098]
1.2体长(body length)；
[0099]
1.3体高(body height)；
[0100]
1.4体宽(body width)；
[0101]
1.5增重率(weight gain rate,wgr,％)＝100
×
(w
t-w0)/w0；
[0102]
1.6肥满度(condition factor,cf,％)＝100
×
wt/l3t；
[0103]
1.7特定生长率(specific growth rate,sgr，％/d)＝100
×
(ln w
t-ln w0)/t；
[0104]
注：w0为鱼初始体质量(g)；w
t
为鱼终末体质量(g)；l
t
试验鱼终末体长(cm)；t为试验天数(d)。
[0105]
2、显著性分析
[0106]
数据在wps excel 2020上进行整理后，在spass 20.0上进行组间差异性分析，显著水平定为0.05，实验数据用平均值
±
标准误表示。
[0107]
3、数据处理
[0108]
在wps excel上对每个时期数据进行整理，并进行显著性分析，实验数据采用平均值
±
标准误表示。作图在graphpad prism5.0上完成。
[0109]
结论：1.本发明尼罗罗非鱼纯合敲除系五月龄mstnb-/-罗非鱼形态及生长性征：
[0110]
五月龄mstnb-/-罗非鱼体型椭圆，轴上肌明显增生，表现出典型的“双肌表型”(图2a)。五月龄生长性能评估结果显示：mstnb-/-罗非鱼(21.67
±
8.26g，n＝21)的平均体重比mstnb
+/+
罗非鱼(14.50
±
8.60g，n＝19)重49.45％(图2b)；mstnb-/-罗非鱼(4.46
±
0.65em)的平均体高比mstnb
+/+
罗非鱼(3.36
±
0.45cm)高32.74％(图2d)；mstnb-/-罗非鱼(2.36
±
0.53cm)的平均体宽比mstnb
+/+
罗非鱼(1.72
±
0.18cm)宽37.21％(图2e)；mstnb-/-罗非鱼(9.46
±
1.07cm)和mstnb
+/+
罗非鱼(9.78
±
0.60cm)的体长没有显著差异(图2c)。此外，5月龄mstnb-/-罗非鱼的增重率(wgr)、肥满度(cf)和特定生长率(sgr)等生长性能参数显著升高(表1)。这些数据表明，mstnb-/-罗非鱼具有较野生型更为良好的生长性能。
[0111]
effects of mstnb gene knockout on growth performance of tilapia at 5mah
[0112][0113]
表1五月龄mstnb基因敲除罗非鱼生长性能检测初始体重，initial body weight；终末体重，final body weight；增重率，wejght gain rate；肥满度，condition factor；特定生长率，specific growth rate。
[0114]
2.本发明尼罗罗非鱼纯合敲除系七月龄mstnb-/-罗非鱼肌肉组织学鉴定：
[0115]
七月龄mstnb-/-罗非鱼(n＝3)躯干头部、中部以及尾部的横截面积均显著大于野生型(n＝3)(图3b，d)。为了阐明mstnb敲除对罗非鱼骨骼肌肌纤维发育的影响，我们任取躯干头部骨骼肌(虚线标注)进行了h&e染色并统计了单位面积肌纤维的数量和尺寸(图3a)。结果显示mstnb-/-罗非鱼单位面积肌纤维的数量(68.25
±
16.09，n＝3)与mstnb
+/+
罗非鱼(73.51
±
11.50，n＝3)无异(图3e)。此外，mstnb-/-罗非鱼与mstnb
+/+
罗非鱼的单位面积肌纤维的尺寸也保持不变(图3f)。因此，这些数据表明导致mstnb-/-罗非鱼肌肉含量增加的原因是肌细胞增生而不是肌细胞肥大。
[0116]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。