T细胞免疫疗法的研究进展

作者：杨超月

嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫疗法通过对人体T细胞进行工程化改造，使T细胞可以特异性靶向清除肿瘤细胞，从而达到精准治疗癌症的目的。目前CAR-T免疫疗法尚不完善，在临床治疗上仍存在许多问题，如对肿瘤识别特异性不强、安全性不高、CAR-T在体内的持久性较差等。研究人员对CAR-T进行了改良，以达到在临床应用中更安全、抗肿瘤效果更好的目标。本文主要对CAR-T面临的挑战和优化策略作一综述。

CAR-T发展进程 CAR-T免疫疗法中CAR的设计是关键，CAR是融合了可以特异性识别抗原的单克隆抗体的单链可变片段（single-chain variable fragments，scFvs），包含可变重链区（variable heavy，VH）和可变轻链区（variable light，VL）与T细胞受体（T cell receptor，TCR）的胞内信号传导域，且表达CAR的T细胞不受MHC限制。目前CAR已经发展到第四代。第一代CAR的scFv只整合了CD3ζ信号域，可以引发肿瘤特异性细胞毒性[]。部分第一代CAR-T细胞显示出长期持久性[]，但是扩增有限且不能诱导有意义的抗肿瘤作用[]。第二代、第三代CAR在CD3ζ上游整合了1个或2个共刺激性结构域（通常是CD28或4-1BB），赋予了T细胞更有效的抗肿瘤细胞作用，同时增加细胞因子的产生，并改善了CAR-T细胞的增殖和持久性[-]。第四代CAR也被称为“装甲CAR”。装甲，即赋予CAR-T一个装备，使其更强大。在第二代、第三代CAR基础上又整合了其他刺激性结构域，共表达一些关键的细胞因子或共刺激配体，旨在修饰肿瘤微环境，如炎性细胞因子IL-12[]、IL-18[]或CD40L[]分泌，以增强抗原交叉呈递并促进表位扩散。纵观这四代CAR，第一代抗肿瘤作用弱，第三、四代虽然T细胞对肿瘤杀伤能力增强但给机体带来的毒副作用也随之增加，相较第三、四代而言，第二代CAR相对温和，在肿瘤治疗中应用更广泛。

CAR-T细胞疗法面临的挑战 当前CAR-T免疫疗法尚未被广泛应用是因为面临三重挑战。

挑战一：克服CAR-T脱靶问题，提升特异识别能力。CAR-T细胞只有对肿瘤表面抗原进行特异性识别，才能确保其仅攻击肿瘤细胞而不对正常组织造成损伤。然而，多项研究表明肿瘤会通过下调或丢失表面抗原来逃逸免疫系统识别，如用靶向CD19的CAR-T去治疗B细胞淋巴瘤后，高达60%的复发以CD19抗原丢失为特征。其中可能的原因是，CD19外显子2~5中发生基因突变，导致CD19蛋白丢失而无法被CAR-T识别[]。在实体瘤中，因异质性和肿瘤微环境使得CAR-T一方面很难找到特异性强、安全性高且不易脱靶的治疗靶点，另一方面肿瘤会被肿瘤微环境保护而免受CAR-T细胞攻击[]，这些均导致CAR-T在实体瘤中的应用更为艰难。

挑战二：确保CAR-T应用的安全性。安全性是应用CAR-T技术的前提条件。在表达CD19 CARs的患者T细胞治疗中观察到明显的毒性，如细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）。CRS的发生与巨噬细胞密不可分，巨噬细胞是炎性细胞因子的主要来源（如IL-6、IL-1和IFN-γ），同时可能参与内分泌和自我扩增的儿茶酚胺环，这些环路可直接激活CRS期间巨噬细胞的产生和细胞因子的释放[]。最近研究揭示了CAR-T疗法中CRS的发生机制，CAR-T识别靶细胞后会释放穿孔素和颗粒酶B，激活caspase3-GSDME途径导致细胞焦亡而发生CRS[]。焦亡的细胞会刺激巨噬细胞激活caspase1-GSDMD产生IL-6和IL-1β，从而引发CRS。该团队还提出，与CAR-T靶向后的细胞不同，被天然T细胞靶向的细胞会经历凋亡途径而非焦亡。可能原因有二，一是CAR-T细胞释放的穿孔素/颗粒酶B比天然T细胞更多且亲和力更高；二是天然T细胞只诱导少量GSDME裂解而不会激活GSDMD[]。机制的阐明可为CAR-T疗法的优化提供新方向。

挑战三：维持CAR-T细胞在体内的持久力。在慢性感染或癌症中，长期的抗原刺激会导致T细胞耗竭状，表现为表面表达多种抑制性受体，包括PD-1、TIM-3和LAG-3等，这些耗竭的T细胞增殖能力差、效应功能低[]。临床前和临床上有充分的证据表明CAR-T同样容易发生耗竭而限制疗效。在无反应者中，肿瘤浸润性CD19 CAR-T上的典型耗竭标志物比表现出完全应答的正常人更高[]。最新研究发现，c-Jun的功能缺陷是T细胞耗竭的关键所在，c-Jun是调节细胞蛋白质水平的主要基因，其缺陷会导致抑制T细胞活性的蛋白质增加[]。如何增强CAR-T在体内的持久性，有效提高CAR-T的抗肿瘤效力是CAR-T技术目前面临的问题之一。

CAR-T技术的优化与改良

增强CAR靶向特异性针对阴性抗原癌细胞的逃逸，对scFv进行优化，通常将其设计为靶向两种抗原，其结合任一抗原都会触发CAR-T的激活。其中，一类是将编码不同CAR的两个载体共转导至单个T细胞[]，或是构建一个双顺反子载体转导进细胞中，使每个细胞上表达两个单独的嵌合受体[]；另一类是使用串联双特异性CAR，胞外部分的两个结合结构域任一对抗原识别即可触发效应子功能。使用双特异性CD20/CD19 CAR-T可治疗复发B细胞恶性肿瘤患者，Ⅰ期临床结果显示在治疗28天后总缓解率达到82%，同时发现输注非低温保存的双特异性CD20/CD19 CAR-T效果更优，接受最高剂量且非低温保存的患者其28天总缓解率可高达100%，这又为CAR-T提出了一种可能性[]。另有研究通过分泌由两个融合的scFv组成的双特异性T细胞接合剂（bispecific T-cell engager，BiTE）来促进内源性非工程T细胞与肿瘤细胞的接合。Choi等[]设计了一种可分泌EGFR/CD3 BiTE的、靶向EGFR-Ⅷ的CAR-T细胞来清除胶质母细胞瘤，已在小鼠模型中得到证实，在治疗3周后80%的小鼠表现出完全缓解，体内无肿瘤存在。这些很好地解决了胶质母细胞瘤由于异质性而难以被完全靶向清除的问题。