BMP2和VEGF165在诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨再生

作者：张馨予

背景因创伤、肿瘤及关节翻修术等原因所致的骨缺损是当前骨外科常见的问题之一。自体骨、异体骨和人工骨是目前骨缺损的主要修复材料来源。自体骨移植因面临二次手术、来源不足、伤口部感染等因素,其临床应用受到了限制；同时,异体骨移植也因存在免疫排异反应、疾病传播及伦理道德等限制,无法在临床广泛应用。构建活性人工骨修复材料为骨缺损的修复提供了方向,而种子细胞和生物活性因子则是构成活性人工骨修复材料的重要要素。活性人工骨修复材料研究对于种子细胞的要求主要为：①适合临床应用需要,即来源广泛、取材简便、创伤小；②诱导后的细胞移植入体内后无免疫排斥反应；③具有多向分化的潜能,在体外扩增达到所要求的细胞数量时保持其成骨表型,在体内外诱导因子的作用下可以扩大增殖。众所周知,干细胞具有多向分化性,控制体外培养条件可使干细胞向成骨细胞、成软骨细胞等方向分化。干细胞包括组织干细胞和胚胎干细胞,胚胎干细胞的使用面临着很多伦理学和安全性的问题,而且体外培养条件要求十分严格,其应用存在很大的局限性。相比较而言,组织干细胞可能是近期内能够应用于骨组织工程尤其是临床应用的最佳种子细胞来源,目前比较明确的能够向成骨细胞转化的组织干细胞主要是骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,可分化成纤维细胞、成骨细胞等,增值能力强,来源广泛,取材方便,供区损伤小,因而倍受人们的关注。生物活性因子在促进骨修复过程中发挥极其重要的作用,骨缺损愈合是骨组织完全性再生的过程,其组织学过程伴随着复杂的分子生物学调节机制,大量活性因子在不同的骨愈合阶段发挥不同的作用,而促进新骨形成和局部血运重建的活性因子显得尤为重要。影响新骨形成研究较为深入的生物因子为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs), BMPs对骨原细胞的分化起决定性作用,是促进成骨的主要因子。BMPs家族成员较多,至今已有40多种BMP蛋白被成功地分离。其中BMP2是转化生长因子β (TGF-β)超家族中的多功能细胞因子,可在骨损伤局部及异位促进细胞增殖,提高其碱性磷酸酶活性,也是唯一能够单独在异位诱导成骨形成的信号分子,这使其在骨关节疾病特别是骨折、骨缺损的临床治疗中具有极大的潜在应用价值。研究表明BMP2是BMP家族成员中骨诱导作用最强的因子,大量实验也证实了将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成。同时,骨组织工程中骨血管化也是一个关键环节,其作用贯穿于整个骨再生修复过程,充足的血供不仅有利于种子细胞的存活、增殖和分化,同时还可加速新骨的形成,从而加快骨缺损的修复。促血管化的生物因子有数十种,Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)是目前公认为作用最强,特异性最高的一种的促血管生成因子,VEGF在血管生成中具有直接和间接的调控作用,一方面可以刺激EC增殖、迁徙,另一方面可以增加血管的通透性,使许多血浆蛋白渗出血管外,这对改造局部的细胞外基质以适应血管生成具有重要作用。VEGF还可以刺激成骨细胞的分化增殖,加速骨的形成和重塑。其中VEGF165是一种分泌性生长因子,广泛地存在于多种组织细胞中,不仅具有促进血管生成活性,而且其表达产物是可溶性的,表达后可从细胞中分泌出来,扩散性强,易到达靶细胞,能很好的发挥生物学活性。自从发现BMP2和VEGF165都参与骨形成,单纯运用生物活性因子于局部发挥作用面临着体内半哀期短、容易被体液冲走或稀释的难题,难保持局部有效治疗浓度。基因技术的发展为我们提供了有效的手段,基因治疗是维持骨缺损局部生物活性因子有效治疗浓度最具有希望的一种方法。目前用作基因治疗的载体主要分为非病毒载体及病毒载体,病毒载体中运用较多的为慢病毒载体,慢病毒(Lenti virus)是一类免疫缺陷性病毒,是由这些病毒引起慢性感染而得名。慢病毒载体也是一类逆转录病毒载体,它既能够感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞,由于慢病毒载体能够感染大多数非分裂细胞,以及具有高效地整合和稳定地表达目的基因于靶细胞的能力,所以已被广泛应用于各种基因治疗实验研究。一些科学家推测,VEGF165结合BMP2相对于单个基因将出现更有效的骨再生效应,这个推测值得信任吗?这将涉及到VEGF165结合BMP2双基因共转染干细胞远期是否能运用于骨缺损修复,因此,评估VEGF165结合BMP2基因在骨再生过程中的作用具有重要意义。目的1、通过慢病毒载体介导VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓间质干细胞,掌握慢病毒转染技术,以便应用于以后其他研究。2、探讨体外VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓间质干细胞在骨再生过程中的作用。材料和方法1、采用分子生物学的方法设计、合成引物,使用PCR的方法扩增VEGF165和BMP2基因,利用基因工程技术构建BMP2慢病毒表达载体和BMP2/VEGF165双基因慢病毒表达载体,限制性核酸内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆,菌落PCR鉴定筛选慢病毒表达载体,测序并与Genebank比较。2、在脂质体Lipofectamine2000介导下将构建成功BMP2和BMP2/VEGF165慢病毒表达载体分别与辅助质粒共转染人胚肾细胞系(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度。3、复苏P3的SD MSC(购自赛业生物公司),经过一次传代后,待细胞状态较好时可用于转染,即使用P5的SD MSC进行转染。慢病毒1(携带BMP2. VEGF165、EGFP和neo)和慢病毒2(携带BMP2、EGFP和neo)分别转染SDMSC,转导48小时后于荧光显微镜下观察转导效果,待两株细胞长至80%融合度时,用0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml三个浓度的G418进行转染细胞株的纯化筛选。4、运用Trizol方法进行SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP两种细胞RNA抽提,进行cDNA链的合成。设计VEGF165、BMP2和GAPDH的引物序列去探测mRNA的表达,转导后第5天的SDMSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SDMSC/BMP2-EGFP两种细胞作为实验组,非转导组作为对照组,Q-PCR法检测各组细胞BMP2、VEGF165mRNA表达。5. SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP两种细胞感染后孵化48小时,感染组作为实验组,非感染组作为对照组,三组细胞分离出来的蛋白质被转移到PVDF转移膜以及膜的封闭,将适当浓度的BMP2和VEGF165—抗和二抗加入到PVDF膜上,将ECL液滴加于PVDF膜表面,置于Fiuorchem HD2凝胶成像分析系统中,观察、拍照。6、SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP两种细胞作为实验组,非感染组作为对照组,每组的细胞进行了3d、7d和14d成骨分化分析。细胞碱性磷酸酶活性检测是由碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒完成。另一方面,三组细胞在成骨分化诱导14天后进行茜素红染色和碱性磷酸酶染色,倒置显微镜拍照；结果1、成功了构建BMP2慢病毒表达载体和BMP2/VEGF165双基因慢病毒表达载体,菌落PCR鉴定及测序与Genebank比较,证明构建的慢病毒表达载体正确。2、BMP2和BMP2/VEGF1651慢病毒表达载体分别转染人胚肾细胞系(293T)后荧光激发可见大量绿色荧光,收集、浓缩病毒后测定其滴度分别为7.45×107TU/ml和6.45×107TU/ml。3、慢病毒1(携带BMP2、VEGF165、EGFP和neo)和慢病毒2(携带BMP2、 EGFP和neo)分别转染SD MSC,转导48小时后于荧光显微镜下观察, SDMSC/BMP2-EGFP转染率约为85%,SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP转染率约为80%,且荧光强。4、对照组没观察到BMP2和VEGF165基因的mRNA表达,在SD MSC/BMP2组未测量到VEGF165mRNA表达,在SD MSC/BMP2+VEGF组可以测量到VEGF165mRNA表达；SD MSC/BMP2和SD MSC/BMP2+VEGF两种细胞都可以测量到BMP2基因的mRNA表达,两组BMP2的表达没有显著性差异(P>0.05)5、免疫印迹分析表明,感染Lv-BMP2-VEGF165和Lv-BMP2骨髓间充质干细胞分泌大量的BMP2,那些非转染的骨髓间充质干细胞BMP2分泌量极低。另一方面,所有的细胞,包括转染和或非转染的骨髓间充质干细胞均分泌大量的VEGF165,6、成骨分化诱导第14天,三组细胞中阳性染色面积最大的是BMP2组,BMP2+VEGF165组的阳性染色面积大于对照组,但小于BMP2组,对照组碱性磷酸酶和茜素红染色均为阴性。在三组细胞中,诱导分化后第14天的碱性磷酸酶活性跟第3天和7天差别有显著性差别(P<0.01)；在诱导分化后第3、7、14天BMP2组ALP活性均显著高于BMP2+VEGF165组(P<0.01)。结论1、VEGF165表达抑制BMP2转染的骨髓间质干细胞在体外分化和骨的生成。2、VEGF基因治疗在体内是否会影响骨再生需要进一步研究。