选质粒，还是有点技术含量的

作者：张馨予

选质粒，还是有点技术含量的

进行基础研究或应用科学研究，多少会涉及到质粒工具，这些质粒无论是自己构建还是别人馈赠或者公司购买前后，我们要尽可能做到知其然知其所以然，便于知悉获得的质粒是否适用于研究目的。

通过这篇文章，尝试解决：如何快速知道质粒上的各种元件并了解我的质粒是否适用于我的实验，如何通过元件解读质粒的提取、质粒转染甚至宿主中的表达和筛选问题？

一、质粒的工具属性-强大的运载工具

实验研究中的质粒是人为改造的重组质粒，改造之处是以天然质粒或简单质粒骨架为基础量体裁衣式地改变大小、重新改编序列组成。除具备自主复制外，质粒可操作性和功能性更强，更具工具属性。

1、克隆质粒

能在宿主细胞中复制扩增，用于测序和保存外源基因。这类载体具有最简单的组成基本元件（ori，Ampr/Kanar,MCS）,没有启动子等启动转录、翻译的元件。

选质粒，还是有点技术含量的

2、基因（过）表达质粒

除克隆载体的基本元件外，还具有启动子等启动转录/翻译所必需的DNA序列。

选质粒，还是有点技术含量的

3、基因敲除/敲降质粒

用于靶向基因敲除和定点编辑。含有目标基因的识别序列或目标基因mRNA的shRNA，实现切断目标基因或mRNA降解，起到基因表达沉默的效果，下调蛋白表达。

二、具备上述属性的源头——作用元件的存在

1.复制起始位点Ori

被宿主细胞复制因子所识别，利用宿主的复制机器，复制，增加拷贝数。因宿主复制机器不同，可分为原核/真核/穿梭质粒。

2.抗性基因

质粒转化是一个效率极低的过程，平均约10000个细胞中有1个细胞转化成功。想象一下，如果没有抗性基因的存在，筛选出阳性克隆的时间将大大延长。并且，外源性存在的质粒要进行复制等活动，会消耗宿主细胞自身的资源，在没有抗生素的培养基中，带有质粒的细胞不占优势，慢慢消失；在抗生素的存在情况下，抗性基因帮助宿主细胞分解抗生素，细胞才会需要质粒。

3.多克隆酶切位点

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。商业化的质粒大多已人为地改造添加多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。

4.标签蛋白/报告基因

常见的标签如6×His、Myc、GST等；常用到的报告基因如β-半乳糖苷酶、GFP、荧光素酶等。

5.表达系统元件

即启动子（Promoter）-核糖体结合位点（RBS）-转录终止信号-增强子。这是用来区分克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些表达系统元件即成为表达载体。对于质粒发挥作用，至关重要！

启动子：是RNA聚合酶结合位点，位于基因表达框的上游。启动子序列控制RNA聚合酶与转录因子的结合，因此对于DNA何时何地转录至关重要。因宿主RNA聚合酶种类不同，质粒中的启动子类型也有所不同。

核糖体结合位点：一般为AUG（起始密码子）。也常常会有SD序列，在起始密码子上游5-10bp处，同16s rRNA 3＇端互补。

转录终止信号：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，下游有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。细菌表达质粒常见的终止子如T7，哺乳动物细胞质粒常见的终止子如SV40、SV40 late polyA、BGH等。

增强子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。

选质粒，还是有点技术含量的