【开讲啦】杨树叶片原生质体的制备和转化prot
【开讲啦】杨树叶片原生质体的制备和转化protocol
2021-12-08 11:00 来源: 伯远生物
原标题：【开讲啦】杨树叶片原生质体的制备和转化protocol
本文由伯小远翻译自Bio-protocol。Bio-protocol是为一线科研人员服务的期刊，其专精于遴选、发表从基础到高级，从传统到创新的各种实验方案。
摘要
从叶子中分离的叶肉原生质体是一种有用的植物研究系统。然而，木本植物杨树的细胞壁含有较多的果胶，使得叶肉原生质体分离变得困难。这也限制了它们在生化、分子、细胞、遗传、基因组、转录组学和蛋白质组学分析中的应用。本文详细介绍了一种简单有效制备和转化毛白杨叶肉原生质体的方法。在组织培养基中生长的毛白杨的叶子先在D-甘露醇溶液中预处理后，用酶溶液消化。再用W5和MMG缓冲液洗涤后，将原生质体和质粒在PEG/Ca2+中孵育进行转化。转化后的叶肉原生质体可表达与绿色荧光蛋白（GFP）融合的组蛋白变体H2B，并能在共聚焦显微镜下成像。“毛白杨叶肉原生质体制备和转化”系统为木本植物研究提供了有用的工具，可应用于基因表达、亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用、染色质免疫沉淀、蛋白质印迹、单细胞测序和基因组编辑等多种研究中。
关键词杨树，叶肉原生质体，瞬时转化，绿色荧光蛋白，亚细胞定位
背景
作为多年生植物，杨树是探索在拟南芥和水稻等一年生植物中不易解决的科学问题的理想模型系统(Jansson and Douglas, 2007)。例如，树叶衰老(Wang et al., 2021)、性别决定(Muller et al., 2020; Xue et al., 2020)、木材形成(Chen et al., 2019)和季节性休眠(Tylewicz et al., 2018)，在杨树中比在一年生植物中更容易研究。杨树的生长通常可跨越数十年、数百年甚至数千年(Munné-Bosch, 2008)，因此有必要建立一个简单快速的系统来研究木本植物的基因功能和信号转导。叶肉原生质体是进行以细胞为基础的基因功能和信号通路研究的通用工具(Yoo et al., 2007)。先前报道的用于制备和转化叶肉原生质体的方案主要集中在模式植物拟南芥上(Yoo et al., 2007)。然而，由于细胞壁成分不同，分离拟南芥叶肉原生质体的方法并不适用于杨树原生质体的制备(Lin et al., 2014)。与之前报道的杨树原生质体制备(Guo et al., 2012; Tan et al., 2013)相比，本文总结的方法更简单（更少的试剂，只需要四种试剂）、更高效（更少的时间，分离和转化仅需大约7h）（图1）。与GFP融合的组蛋白变体HTB9在P. tomentosa叶肉原生质体中瞬时表达（图2）。此外，该方法还可以应用于其他杨树物种的叶子，如白杨、毛果杨、84K和Populus davidiana×P. bolleana，或其他木本物种的叶子，如在组织培养基中生长的Eucalyptus urophylla×E. grandis或Eucalyptus grandis×E. urophylla。
材料和试剂
1. 10mL离心管（HOUDIOR）
2. 1.5mL离心管（Axygen）
3. 刀片（吉列，超级吉列蓝刀片，4.3cm×2.2cm）
4. 培养皿（直径90mm）
5. 玻璃底培养皿（In Vitro Scientific，目录号：D35-10-1.5-N）
6. 过滤器，400目（BIODEE，目录号：DE2009）
7. 纤维素酶“ONOZUKA”R-10（Yakult，目录号：L0012-10g）
8. Macerozyme R-10（Yakult，目录号：L0021-5g）
9. 果胶酶Y-23（Yakult，产品代理（BIODEE）目录号：AOV0094-1g）
10. MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671-50G）
11. PEG4000（Sigma-Aldrich，目录号：81240-1KG）
12. D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021-100G）
13. β-硫甘醇（Amresco，目录号：0482-100mL）
14. BSA（Amresco，目录号：0332-100g）
15. D-甘露醇（BIODEE，目录号：BN20023-250g）
16. KCl（BIODEE，目录号：DE-0395A-250g）
17. NaCl（BIODEE，目录号：DE0008-500g）
18. MgCl2·6H2O（BIODEE，目录号：DE-0288A-500g）
19. CaCl2（BIODEE，目录号：DE-0556A-500g）
20. 质粒（溶于双蒸水，2µg/µL）
21. 酶溶液（见配方）
22. W5溶液（见配方）
23. MMG溶液（见配方）
24. PEG/Ca2+溶液（见配方）
25. D-甘露醇溶液（见配方）
仪器设备
1. 1,000µL微量移液器（Eppendorf）
2. 200µL微量移液器（Eppendorf）
3. 10µL微量移液器（Eppendorf）
4. 细胞计数板（MARIENFELD，型号：MARIENFELD-0650030）
5. 锥形瓶（Bomex，50mL、500mL）
6. 植物培养箱（Percival，型号：AR-36L3）
7. 细菌摇床培养箱（Crystal Technology & Industries，型号：IS-AX-190L）
8. 离心机（Eppendorf，型号：5804R）
9. 共聚焦显微镜（Carl Zeiss，型号：Zeiss LSM780）
实验步骤
1. 准备毛白杨材料并配置溶液
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