用于AAV病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法

作者：张馨予

用于aav病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因与细胞治疗药物载体技术领域，具体涉及用于腺相关病毒(aav)包装的可提高病毒滴度的辅助质粒载体、其制备方法和应用。

背景技术：

2.腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)是一种单链dna、无包膜、二十面体的病毒，属于依赖细小病毒属。aav对人无致病性，它们最初被发现是腺病毒制剂的污染物，需要与腺病毒或疱疹病毒共感染才能有效复制。aav病毒的包装目前最常用的是aav无辅助病毒系统(aav helper-free system)，可以在无辅助病毒的条件下生产重组腺相关病毒，这种系统为aav生产细胞与三个质粒的共转染，三个质粒分别为带有aav itr的载有目的基因的穿梭质粒、带有rep-cap的表达不同血清型的包装质粒、提供从腺病毒分离的辅助基因(如e2a、e4等)的辅助质粒。aav包装的基因组删除了全部aav蛋白编码序列基因，添加了治疗性基因表达盒，基因组的两端序列是itr为反向重复序列，为aav包装所必需，在载体生产过程中指导基因组复制，这使得重组aav(raav)的包装能力最大化，raav基因组整合到人细胞中的几率大大减少，有助于在体内递送时的低免疫原性和细胞毒性。一些人类疾病的基因治疗方法正在利用重组aav(raav)载体开发生物制剂。
3.然而该病毒载体的商业化生产过程非常困难，难以获得较高的病毒载体生产效率，极大地提高了该病毒载体的生产成本。通过改造重组质粒结构，提高病毒包装滴度，对于增强其应用至关重要。

技术实现要素：

4.为克服上述缺陷，本发明利用sv40 ori作为强启动元件，提供一种可提高病毒包装滴度的用于aav包装的辅助质粒载体、其构建方法和应用。具体的：
5.本发明第一方面，提供一种辅助质粒载体，所述的辅助质粒载体含有sv40复制起始位点(sv40 origin of replication，sv40 ori)序列。
6.优选的，所述sv40 ori序列与seq id no：1第1-136位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述sv40 ori序列如seq id no：1第1-136位所示。
7.优选的，所述辅助质粒载体还包括筛选用的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶基因(npt)、卡那霉素抗性基因(nptii)、硫酸卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因，氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等等。更优选的，所述抗性基因是硫酸卡那霉素抗性基因。
8.更优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因与seq id no：1第950-1744位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，进一步优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因序列如seq id no：1第950-1744位所示。
9.在一个具体的实施方式中，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列的核
苷酸序列与seq id no：1所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列的核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.优选的，所述辅助质粒载体还包括e4、e2a、va基因。
11.本发明第二方面，提供一种辅助质粒载体的构建方法，所述构建方法包括：将sv40 ori插入到辅助质粒中。
12.优选的，所述sv40 ori序列与seq id no：1第1-136位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述sv40 ori序列如seq id no：1第1-136位所示。
13.优选的，所述构建方法包括(1)、从骨架质粒中扩增sv40 ori序列片段，酶切获得sv40ori序列片段；(2)酶切辅助质粒；(3)连接转化，将步骤(1)和(2)的片段以dna连接酶连接，转化感受态宿主细胞，构建获得包含sv40 ori序列的辅助质粒载体。
14.更优选的，所述构建方法步骤(1)中的扩增引物序列如seq id no：2和seq id no：3所示。
15.更优选的，所述构建方法步骤(2)中获得包含硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列的片段，所述步骤(3)中利用硫酸卡那霉素筛选。进一步优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因与seq id no：1第950-1744位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因序列如seq id no：1第950-1744位所示。
16.在一个具体的实施方式中，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列的核苷酸序列与seq id no：1所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列如seq id no：1所示。
17.本发明第三方面，提供一种上述辅助质粒载体在重组腺相关病毒包装中的用途。
18.本发明第四方面，提供一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包括上述辅助质粒载体。
19.优选的，所述重组腺相关病毒为任意血清型重组腺相关病毒，例如aav1、aav2、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9等等。
20.本发明第五方面，提供一种重组腺相关病毒的制备方法，所述制备方法包括：将上述辅助质粒载体、穿梭质粒和包装质粒共转染到宿主细胞。
21.优选的，所述穿梭质粒包括报告基因，更优选的，所述报告基因选自cat、hgh、seap、rfp、gfp或egfp、β-gal或萤火虫荧光素酶基因。
22.优选的，所述包装质粒包括rep和cap基因。
23.优选的，所述宿主细胞包括任意的表达sv40病毒t抗原的细胞；例如：大肠杆菌、酵母菌、hek293、hek293t等等。
24.本发明第六方面，提供一种上述辅助质粒载体或重组腺相关病毒在表达外源基因中的用途。
25.本发明第七方面，提供一种外源基因的表达方法，所述表达方法包括：利用上述辅助质粒载体或重组腺相关病毒表达外源基因。
26.本发明的有益效果在于：
27.1、本发明所述的质粒载体含有sv40 ori序列，可显著增强真核表达效果，提高包装病毒滴度，有助于增加raav载体的治疗价值。
28.2、aav包装用辅助质粒提供了生产具感染性的aav颗粒所需的腺病毒基因产物(e4、e2a、va基因)，其余的腺病毒基因产物则由宿主细胞，经过腺病毒e1a基因的转染，能够表达sv40大t抗原。辅助质粒中添加sv40 ori，可以在表达sv40病毒t抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。
附图说明
29.图1为骨架质粒图谱。
30.图2为helper质粒载体图谱。
31.图3为ym-helper质粒载体图谱。
32.图4为ym-helper质粒酶切片段。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
35.实施例1：ym-helper质粒的构建
36.构建思路为：设计特异性pcr引物，将骨架质粒中含硫酸卡那霉素抗性基因和sv40 ori序列片段(序列如seq id no：1)扩增出来，其中骨架质粒图谱如图1所示，再将模板质粒(含e2a、e4基因序列，模板质粒载体图谱如图2所示)，使用bsp1407i/mssi双酶切后，两者连接得到ym-helper质粒(参见图3)。
37.具体步骤如下：
38.pcr：设计扩增dna片段所需的特异性引物扩增骨架质粒(质粒来源山东维真巴西vs瑞士让球有限公司)，具体见表1。
39.表1：pcr引物序列
[0040][0041]
pcr体系见表2：
[0042]
表2：pcr体系
[0043]
试剂体积/μltemplate(plasmid)1
primer-f(10μmol/l)1primer-r(10μmol/l)1phusion0.25
×
gc buffer4dntp(10μmol/l)0.4betaine solution4.4h2o8total20
[0044]
pcr程序：98℃，3min；98℃，20s；64℃，30s；72℃，3min；98℃，20s；62℃，30s；72℃，3min；(98℃，20s；60℃，30s，72℃，3min)*30times，72℃，5min；
[0045]
(2)酶切
[0046]
将上述pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，利用pcr纯化回收试剂盒回收目的条带，进行酶切，酶切体系见表3。
[0047]
表3：pcr产物酶切体系
[0048]
试剂体积/μlpcr产物(0.5μg/μl)410
×
buffer5bsp1407i1.5mssi1.5h2o38total50
[0049]
(3)将模板辅助质粒(来源于山东维真巴西vs瑞士让球有限公司)进行酶切，酶切体系见表4：
[0050]
表4：helper质粒酶切体系
[0051]
试剂体积/μlhelper质粒(0.1μg/μl)810
×
buffer5bsp1407i1.25mssi1.25h2o34.5total50
[0052]
将上述反应37℃放置2h，使用胶回收试剂盒回收目的条带。
[0053]
(4)连接转化
[0054]
将上述条带使用t4 dna连接酶进行连接后，转化进e.coli dh5α感受态细胞，硫酸卡那霉素筛选后，质粒提取得到ym-helper质粒，对得到质粒产品采用bsp1407i/mssi双酶切验证，凝胶电泳图见图4，酶切后质粒条带大小约为9kbp、2.6kbp。
[0055]
实施例2：aav病毒包装应用
[0056]
为了评估构建后的质粒的包装应用效果，设置对比例与本发明的辅助质粒载体进行对比。
[0057]
对比例1(helper)：使用构建前不带sv40 ori序列的辅助质粒helper进行aav病毒包装和纯化。该包装过程使用hek293t贴壁细胞，为便于滴度检测，使用带gfp的aav穿梭质粒(pav-cmv-gfp质粒)和rc8包装质粒共转染，包装容器为10cm2培养皿，纯化后检测病毒包装滴度。
[0058]
对比例2：本发明ym-helper(实施例1构建的辅助质粒)，使用构建后带有sv40 ori序列的辅助质粒ym-helper进行aav病毒包装和纯化。该包装过程使用与对比例:1同批的hek293t贴壁细胞，使用对比例1中aav穿梭质粒(pav-cmv-gfp质粒)和rc8包装质粒共转染，包装容器为10cm2培养皿，纯化后检测病毒包装滴度。
[0059]
结果见表5。
[0060]
表5：病毒包装滴度对比
[0061][0062]
从表中可以看出，对比例2的病毒包装滴度要明显高于对比例1，结果证实，本发明构建得到的质粒用于病毒包装可显著提高病毒滴度。
[0063]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0064]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0065]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。