专访青岛能源所王士安丨发现酵母基因编辑中高

作者：杨超月

合成生物学涉及到了对微生物代谢系统的改变甚至重构，基因编辑和高通量测序是重要的支撑技术。CRISPR-Cas9 基因编辑技术被形象地称为 “基因剪刀”，该技术自 2012 年问世至 2020 年获得诺贝尔化学奖，仅历时 8 年。

目前，CRISPR-Cas9 技术已广泛应用于生命科学研究的诸多领域。自 2013 年在 Science 上发表论文，首次将 CRISPR/Cas9 基因编辑技术改进并应用于哺乳动物和人类细胞以来，CRISPR 基因编辑技术开始在遗传病治疗和肿瘤治疗领域大放异彩。

就在去年，中国首个基因编辑治疗地中海贫血临床试验申请已经获批。地中海贫血是世界上分布最广、患病人数最多的单基因遗传病，也是我国影响最大、发病率最高的遗传病。仅在中国，就有大约 3000 万地中海贫血基因携带者。

CRISPR-Cas9 的技术原理包括向导 RNA 引导的 Cas9 靶向 DNA 切割和 DNA 修复两个基本过程。之前的研究发现，CRISPR-Cas9 编辑哺乳动物细胞的 DNA 修复结果以插入 / 缺失为主，少量的染色体重排和碱基替代并未受到重视。

为了避免基因编辑技术在基因治疗中产生非预期的副作用，发展无脱靶、精确可控的基因编辑技术极为重要，充分认识 CRISPR-Cas9 编辑介导的 DNA 修复结果有助于技术的发展。

中国科学院青岛生物能源与过程研究所的研究员在开展红法夫酵母基因编辑研究中，发现了高频的碱基替代（点突变）修复，并由此系统地开展了 CRISPR-Cas9 介导的 DNA 修复结果分析和机制探究。相关论文发表在 CRISPR 期刊上，题为 “”。

“我们想到，这一现象同样可能发生在应用于人体的治疗过程中，非预期的点突变可能会造成不可控的后果。我们期望通过论文的发表，能够带动更多的研究人员关注这类修复结果。”这样告诉生辉 SynBio。

2003 年毕业于陕西师范大学生物科学专业；同年考入中科院微生物研究所微生物学专业（硕博连读），开展酵母菌资源和分子系统学研究；2008 年博士毕业后到中科院青岛生物能源与过程研究所工作至今，主要研究方向为酵母菌生物技术（Yeast Biotechnology）；工作期间，2013 年至 2014 年，赴美国麻省理工学院化工系学习代谢工程。目前，主要聚焦 GRAS 级（通常认为安全）酵母底盘，开展油脂和蛋白合成研究。

“目前精确基因编辑仍然难以实现”

“我们在开展红法夫酵母基因编辑研究中发现了高频的碱基替代（点突变）修复，经验证其不是随机发生的，而是在特定靶点出现的点突变。”

团队由此系统地开展了 CRISPR-Cas9 介导的 DNA 修复结果分析和机制探究。

团队从转化 CRISPR-Cas9 的 102 万个红法夫酵母转化子中鉴定到 476 个自然修复克隆，采用 Sanger 测序、Illumina 测序、序列结构变异分析、染色体核型分析、遗传突变分析和统计分析等方法，全面分析了 DNA 修复类型，并系统探究了修复产生的原因。

结果发现，在红法夫酵母中 CRISPR-Cas9 基因编辑介导的 DNA 修复类型多种多样，包括 DNA 插入 / 缺失、点突变、染色体易位、短片段反向互补等，并展现了多种新特征。其中，1 kb 以上的 DNA 缺失并不罕见；点突变非随机地出现在特定靶位点，这不同于在 Hela 细胞和酿酒酵母中鉴定到的少量碱基替代；染色体易位重复性地发生在两个 DNA 断裂处。

▲图丨基因组深度测序鉴定基因编辑中的点突变（来源：CRISPR）

研究还发现，点突变和 DNA 缺失强烈依赖 NHEJ 修复途径中的 Ku70、Ku80、Mre11 和 RAD50 基因，失活其中任何一个基因都导致 DNA 修复能力急剧下降。并且，点突变和 DNA 缺失还依赖非保真 DNA 聚合酶 REV3 或 Pol4，同时失活 REV3 和 POL4 基因也导致 DNA 修复能力明显下降。

他表示，尽管 CRISPR-Cas9 基因编辑技术已经产生了革命性影响，但是在基因治疗领域的应用还需要更加谨慎，目前精确基因编辑仍然难以实现。

“该项研究虽然以微生物为对象，但是对哺乳动物细胞的基因编辑研究也具有启发作用。与该研究发现具有类似性，人类癌症细胞中的大量点突变由非保真 DNA 聚合酶产生，并且人体细胞以 NHEJ 为主要的 DNA 修复机制。然而，以往研究并未足够重视 CRISPR-Cas9 介导的人体细胞的自然 DNA 修复类型，尤其是点突变，相关研究应予以加强，以确保基因编辑技术在疾病治疗中的安全应用。届时，该研究会指导 CRISPR 系统在基因治疗中的具体操作，包括通过计算的方式选择靶点，或者精确的体外评价。”