基因治疗“宠儿”： AAV腺相关病毒载体解析

作者：杨超月

近年来腺相关病毒(AAV)载体逐渐发展为基因治疗领域的热门递送平台，相关研究在AAV载体衣壳的优化、病毒基因组的设计等方面取得了巨大进展，大大促进了基因治疗领域的发展，尤其是最近两款基于AAV的基因疗法获批之后，引起了人们对AAV病毒载体的极大关注。

AAV载体发展史

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AAV载体发展时间线

腺相关病毒(AAV)最早于1965年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现，在对AAV进行研究的前15-20年的时间里，科学家们主要将研究方向集中在AAV的基因结构与组成、DNA的复制与转录、感染的潜伏性以及病毒粒子的组装等方面，并于1982年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作。在经历了长达20多年的基础理论研究之后，AAV的神秘面纱逐渐被揭开，这些早期研究为AAV作为基因递送载体而被广泛使用提供了坚实的理论基础。

AAV载体于1995年首次用于治疗人类的囊性纤维化病，步入21世纪后越来越多的AAV血清型家族被发现，这极大的丰富了体内基因递送的AAV载体工具箱。2008年基于AAV载体的基因疗法在治疗莱伯氏先天性黑蒙症的疗效方面取得了令人信服的证据。2012年首个基于AAV的基因治疗药物Glybera(用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症LPLD)获得了欧洲药品管理局EMA的批准，5年后Luxturna成为首个获得美国食品药品管理局FDA批准的用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品。

尽管基于AAV载体的基因治疗产品在临床上取得了令人鼓舞的结果，但必须要承认的是这种新型的体内基因递送平台同样存在很大的局限性与挑战性，例如从科学角度来看AAV载体在体内与免疫系统的相互作用往往导致疗效大打折扣，再比如说从生产角度来看AAV载体的生产规模、制造成本以及产品定价往往很难平衡，这些问题将直接导致产品最终上市后的受益人群的范围以及市场规模等。基于这些面临的问题与挑战，越来越多的AAV生物学研究以及临床转化试验正在如火如荼的进行当中。

野生型AAV构造

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AAV衣壳晶体结构

AAV属于细小病毒科依赖性细小病毒属，它由一个直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和一个约4.7 kb的单链DNA基因组组成，该基因组可以是正义链也可以是反义链。病毒衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚基构成，三种亚基的比例为1：1：10，共60份拷贝。目前的普遍共识是AAV病毒不会引起人类疾病，安全性非常高。

基因组两侧有两个T型末端反向重复序列(ITRs)，它们主要担任病毒复制起点和包装信号的角色。基因组主要由rep基因和cap基因构成，其中rep基因负责编码病毒复制所需的四种蛋白质Rep78，Rep68，Rep52和Rep40(按分子量命名)，cap基因通过不同起始密码子的选择性剪接和翻译实现三种衣壳亚基的编码。除此之外，负责编码装配激活蛋白(AAP)的第三个基因被编码在cap编码序列的不同阅读框中，此蛋白已被证明可以促进病毒粒子的装配。

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AAV基因组结构

在人类细胞中AAV基因组可以整合到一个被称为AAVS1的基因组位点从而实现长期潜伏，这一现象的部分原因是AAVS1位点的序列和ITR的序列有很大的相似性，位点的插入同样需要rep基因编码蛋白的活性，因为人们发现缺乏rep基因的重组AAV载体的基因组整合效率大大降低。

野生型AAV转变成

重组AAV载体的改造方式

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重组型AAV载体的基因组拆分示意图

为了将野生型AAV变成适合体内基因递送的重组型AAV载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型AAV载体的病毒衣壳依然沿用野生型AAV的序列与构造，但是病毒衣壳内部的基因组被完全剔除了rep基因和cap基因，仅仅保留有了负责引导病毒载体基因组复制和包装的ITRs序列。rep基因和cap基因的位置被需要递送的基因以及表达调控元件所替代，与野生型AAV相比，这种改造在很大程度上提高了AAV载体的装载量并极大降低了体内免疫原性和毒性。