mRNA工艺技术平台之质粒DNA原液

作者：杨超月

mRNA疫苗或药物的生产工艺，主要分为质粒DNA原液制备、mRNA原液制备、mRNA制剂制备三个阶段。本文先总结第一阶段的工艺平台。

质粒DNA制备的基础是转录模板的序列设计，制备方法通常采用质粒DNA扩增，也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例，通常采用工程菌E.coli发酵来扩增，因此mRNA生产工艺的源头是工程菌种子库的建立和检定。建立种子库系统后，mRNA实际生产工艺是从工作菌种库的复苏开始的。

▲ E.coli基因工程建造以建立菌种库

从菌种复苏开始，质粒DNA的生产主要经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装储存等步骤，流程示意如下图。不同产品在具体工艺方案选择上可能存在差异，比如裂解、沉淀、层析等，此处仅基于典型工艺进行探讨。

▲ 线性化质粒DNA生产工艺流程

发酵培养

从复苏的菌种开始，经过多级扩增培养，以达到生产规模培养所需的菌种数量，此为菌种扩增。然后按所需生产规模进行生产发酵培养，使质粒DNA达到足够的复制数量，以满足最终质粒产量的要求。

▲ E.coli发酵扩增

▲ 大规模发酵培养

在菌种扩增和生产发酵阶段需要用到设备耗材相对来说是比较传统的产品，在行业内有较成熟的供应体系，可选项比较多，竞争较为激烈，国产厂家也不少。

具体来看：

菌种复苏：传统方法是采用恒温水浴，价格便宜，厂家众多，然而不太适宜于洁净室应用、样品污染风险较高、手工操作差异较大，因此程序复苏仪被越来越多地采用，比Biolife ThawStar, 聆岸LA-G007干式复苏仪, 原能CR-200细胞复苏仪, 洛尚DHB-200恒温金属珠浴等。

CO2培养箱：不论是进口还是国产，选择比较多，如Thermofisher (Forma), ESCO (CelMate), Sanyo/Panasonic (MCO), Infors (Minitron) , 一恒 , 喆图等。

细菌培养发酵罐，规模较小时常用玻璃罐，较大时则用不锈钢罐，也有采用袋子或罐子的一次性发酵罐，如NBS/Eppendorf (BioFlo) , Solaris (Jupiter) , Infors (Minifors/Techfors) , Bionet , BBI (Xc ubio) , 高机 , 日泰 , 齐志/多宁 , 国强 , 英德/新华 , 百伦 , Thermofisher (Hyperforma SUF) , Cytiva (Xcellerex XDR) , Cercell等。

收获澄清

由于大量复制的质粒存在于菌体内，需要收集菌体、重悬、裂解以释放质粒DNA，以便于后续分离纯化。菌体的收集可以采用离心或切向流过滤的方式。菌体重悬需注意缓冲液成分和菌体比例。菌体裂解方法有很多，如高压匀破碎、超声裂解等，但以碱裂解最为常用。

碱裂解后的裂解液需要先中和，再经固液分离得到澄清收获液，用于后续分离纯化。部分工艺也采用沉淀法去除RNA。澄清工艺常通过离心、微滤或深层过滤的方式去除菌体碎片和部分絮凝物。

实验室离心机受限于其操作，难以在大规模商业化生产中实施。工业上常用连续流离心机，但其剪切力较高。中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品，并且具有良好的放大能力。

收获澄清步骤所用到的设备耗材种类较多，但也是比较成熟的产品，简要说明如下：

离心机：实验室离心机进口和国产都有选择，如Beckman / Danaher (Avanti / Optima) , Thermofisher (Sorvall) , 湘仪 , 湘智 , 卢湘仪等；连续流离心机主要还是GEA , Alfa Laval；市场上已有一次性离心机推出，如PSA (CARR) , Sartorius (Ksep) , Alfa Laval (CultureOne) , GEA (Kytero)等。

切向流过滤：分为设备系统和耗材部分，耗材有膜包和中空纤维两种形式，国产设备相对较多且与进口品牌形成正面竞争，但耗材相对较弱。主要厂家有Repligen (TangenX, KrosFlo) , PALL , Merck (Pellicon) , Sartorius (Sartocon, Hydrosart) , Cytiva (Uniflux, Readyflux) , AsahiKASEI , 科百特 Consieve , 利穗等。

深层过滤：用于澄清过滤，主要有Merck (Mobius, Millistak) , Sartorius (FlexAct, Sartoclear) , Pall/Danaher (STAX) , 3M (Zeta Plus) , 科百特 (Claricap) , 九龄等。

精制纯化