TA克隆原理及方法

作者：杨超月

16℃连接过夜。

（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

1 材料

E.coli JM109菌株

2 仪器、用具

超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器

3 试剂

(1) CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基

(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇的Buffer W2a

(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液

(4) 酚；氯仿；异戊醇

(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶

4 方法

1. 大肠杆菌感受态细胞的制备

(1) 取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl 转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。

(2) 4℃，5000rpm离心2min，去上清液。

(3) 加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。

(4) 4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。

2. 重组DNA的转化

(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

(2) 于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。

(3) 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。

(4) 在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。

(5) 将200μl 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。

注意事项：

① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。

② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。

③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

3．重组质粒的鉴定

方案一菌落PCR

(1) 制备PCR混合液：

(2) 用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中

(3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。

(4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。

(5) 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条

件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。

(6) 取5μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

方案二质粒PCR

1. 碱裂解法少量制备质粒DNA

(1) 用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。

(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。

(3) 加入250μl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。

*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

(4) 加入400μl Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。

*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。

(5) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。

(6) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。

(7) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer

W2洗涤一次。

(8) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。

(9) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜

中央加入25-30μl Eluent或去离子水。

(10) 室温静置2 min，14000rpm离心1min洗脱DNA。

(11) 取5μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。

2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

(1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300μL。

(2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3min。

(3) 14000rpm 离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3min。

(4) 14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3min。

(5) 14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，沉淀质粒DNA。

(6) 14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200μL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。

(7) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

3. 质粒PCR

(1) PCR反应体系如下：

(2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：

94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。

(3) 取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。

二、PCR产物的克隆

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。