一种高效的dna接头连接方法

作者：杨超月

一种高效的dna接头连接方法【专利摘要】本发明公开了一种高效的接头连接方法。该方法包括：使用A型DNA聚合酶或DNA聚合酶Klenow片段处理DNA分子以添加3’dA突出端，再将处理后的DNA分子与接头混合物进行连接，得到连接产物，其中，所述接头混合物包括三种双链DNA接头，它们的一端分别为平末端、3’dT突出端和3’dC突出端。该方法可有效提升接头与DNA的连接效率。【专利说明】一种高效的DNA接头连接方法
技术领域：
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种重组DNA构建方法，即高效的DNA接头连接方法。【
背景技术：
】[0002]接头，是指化学合成的双链DNA分子，包括三种不同的类型:平末端接头，其两端都是平末端;TA接头，一端是平末端而另一端有3'端突出的dT碱基;粘末端接头，一端是平末端而另一端为粘性末端。其中，粘末端接头可与限制性内切酶消化后的DNA分子连接，被用于文库构建等应用。[0003]Clark等（ClarkJM.Novelnon-templatednucleotideadditionreactionscatalyzedbyprocaryoticandeucaryoticDNApolymerases.NucleicAcidsRes.1988,16:9677-9686；Hu,G.DNApolymerase-catalyzedadditionofnontemplatedextranucleotidestothe3'endofaDNAfragment.DNACellBiol.1993,12:763-770)发现，某些DNA聚合酶可以在DNA片段的3'末端催化添加A碱基而不依赖模板，这一发现奠定了TA克隆（TAHoltonandMWGraham，AsimpleandefficientmethodfordirectcloningofPCRproductsusingddT-tailedvectors.NucleicAcidsRes.1991，9:1156)和二代测序文库构建（StevenR.Head，H.KiyomiKomori，SarahA.LaMere,Thomasffhisenant,FilipVanNieuwerburgh,DanielR.Salomon,andPhillipOrdoukhanian,Libraryconstructionfornext-generationsequencing:Overviewsandchallenges.BioTechniques，2014，56:61_77)等一系列技术的基础D然而已有学者发现，3'末端dA的添加效率因模板而异，如Brownstein等发现，3'末端dA的添加效率依赖于PCR产物3'末端的核苷酸碱基组成，并于4%~75%之间波动（<1.]\1.：61'〇￥118七6；!_11，<1.0.〇3印七61^&11(1J.R.SmithModulationofNon-TemplatedNucleotideAdditionbyTaqDNAPolymerase:PrimerModificationsthatFacilitateGenotypingBioTechniques，199620:1004-1010);又如]\^811118〇11等发现，当？0?产物的3'末端核苷酸分别为(：、1'、6^碱基时，其对应的加A效率分别为80-85%、75-80%、45-50%、20-30%(V.L.Magnuson，D.S.Ally，S.J.Nylund,Z.E.Karanjawala,A.L.Lowe,S.GoughandF.S.Collins,SubstrateNucleotide-DeterminedNon-TemplatedAdditionofAdeninebyTaqDNAPolymerase:ImplicationsforPCR-BasedGenotypingandCloningBiotechniques1996，21:700-709)。[0004]与传统的Sanger测序方法相比，二代测序技术使得科学家们可以更加快速、廉价地对DNA与RNA进行测序，彻底变革了分子生物学与基因组学的研究（Quai1，M.A.，I.Kozarewa,F.Smith,A.Seally,P.J.Stephens,R.Durbin,H.Swerdlow,andD.J.Turner.Alargegenomecenter'simprovementstothe11luminasequencingsystem.Nat.Methods2008,5:1005-1010)。标准的二代测序文库构建包括如下步骤：（i)片段化，（ii)末端修复，末端磷酸化，（iv)3'末端加dA，从而可与测序接头连接，（v)连接接头，（vi)通过PCR富集两端均成功连接接头的产物。（StevenR.Head，H.KiyomiKomori,SarahA.LaMere,Thomasffhisenant,Fi1ipVanNieuwerburgh,DanielR.Salomon,andPhillipOrdoukhanian,Libraryconstructionfornext-generationsequencing:Overviewsandchallenges.BioTechniques，2014,56:61-77)〇由于TA接头与相应DNA的连接效率显著高于平末端连接，因此需要用Taq或exoKlenowDNA聚合酶为DNA3'端添加dA突出端。据Neiman等估算，仅有约1/16的DNA分子两端均带dA突出端（MartenNeiman,SimonSundling,HenrikGiOilberg,PerHall,KamilaCzene,JohanLindberg,DanielKlevebring,LibraryPreparationandMultiplexCaptureforMassiveParallelSequencingApplicationsMadeEfficientandEasy.PLOSOne2002,7:e48616)。尽管也有学者开发或改进了一些DNA聚合酶以增加dA尾的添加效率(ENZYME⑶MPOSITIONFORDNAENDREPAIR,ADENYLATION,PHOSPHORYLATION.UnitedStatesPatentApplication20150087557；ThermostableViralPolymerasesandMethodsofUse.UnitedStatesPatentApplication20080268498)，但即使是在优化后的反应条件下使用这些酶，加A效率依然不尽如人意。因此，迫切需要开发一种简便的方法，用以提升接头与DNA的连接效率。【
发明内容】[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种高效的DNA接头连接方法构建重组DNA。该方法可用于基因克隆、文库构建、二代测序文库构建等。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：[0007]一种高效的DNA接头连接方法，该方法包括：使用A型DNA聚合酶或DNA聚合酶Klenow片段处理DNA分子以添加3'dA突出端，再将处理后的DNA分子与接头混合物进行连接，得到连接产物，其中，所述接头混合物包括三种双链DNA接头，它们的一端分别为平末端、3'dT突出端和3'dC突出端。[0008]进一步地，所述三种双链DNA接头除了上述一端序列结构（例如平末端、3'dT突出端和3'dC突出端)不同外，其余DNA序列可以完全相同，也可以不同。[0009]发明人发现A型DNA聚合酶对双链DNA分子3'末端dA的添加效率因模板而异，且还可以在3'末端添加不依赖模板的其他核苷酸如dG，得到的反应产物是末端分别为平末端、3'dA突出端、3'dG突出端三种结构的一系列DNA分子的混合物，由于仅有极少的DNA分子两端均带3'dA突出端。传统的3'dT突出端接头仅能与这极少一部分DNA分子连接，在其两端成功添加接头;大部分分子均无法在两端成功添加单一末端结构的3'dT突出端接头。本发明使用3种具有不同末端结构的双链DNA接头混合物代替传统的3'dT突出端接头，接头混合物中的平末端、3'dT突出端、3'dG突出端，分别对应加A反应后，DNA分子末端可能具有的平末端、3'dA突出端、3'dG突出端三种结构，并分别与其连接。因此，无论DNA分子的加A效率如何，具有何种末端结构，均有与之相匹配的接头相连接，确保了分子两端添加接头效率的显著提升，见图1。[0010]进一步地，上述方法中，使用的A型DNA聚合酶即可以是单纯的A型DNA聚合酶，也可以是含有A型DNA聚合酶的混合聚合酶，包括但不限于，TaqDNA聚合酶、EasyTaqDNA聚合酶、TransTaqHiFiDNA聚合酶、PlatinumTaqDNA聚合酶等。[0011]进一步地，上述方法中，将处理后的DNA分子与接头混合物进行连接时，通常使用T4DNA连接酶。[0012]进一步地，本发明所述DNA分子为PCR产物、二代测序建库过程中经过打断与末端修复的DNA片段或直接提取并经过修复的DNA片段。[0013]进一步地，为了确保双链DNA接头不会与加A反应后的DNA分子相连接，保证接头连接的方向性，优选地，本发明所述的三种双链DNA接头一端分别为上述3种结构，即平末端、3'dT突出端和3'dC突出端，而另一端可以为粘性末端，见图1;也可以为两条不互补的单链末端(Y型结构），见图2;还可以为茎环结构，见图3。[0014]本发明所述双链DNA接头可以通过化学合成或其它分子生物学方法获得，其一端具有三种不同的结构，可以在连接酶作用下，与具有互补末端结构的DNA分子连接。在本发明的具体实施方案中，双链DNA接头可以用两条合成的反向互补的单链DNA退火制备;也可以用一条合成的两端具有互补序列的单链DNA退火制备。[0015]本发明的有益效果如下：[0016]传统二代测序文库构建方法中，为了在DNA两端都能连接接头，不依赖模板的加A反应必须在DNA两端都要发生。然而现有研究成果表明，A型DNA聚合酶或DNA聚合酶K1enow片段催化的加A反应效率十分低下且因模板而异，仅有约1/16的DNA分子两端均带dA突出端。因此，只有极少数分子可在加A后，两端均成功连接接头，进而，低下的加A反应效率严重制约了文库构建效率。[0017]为解决此问题，传统方法多为利用各种手段提升DNA聚合酶的加A反应效率。但受制于酶本身的催化能力，此类方法收效甚微。[0018]与传统方法相比，本发明提供的一种高效的DNA接头连接方法，使用的接头混合物包括二种双链DNA接头，即平末纟而接头、3dT关出纟而接头和3dC关出纟而接头，可以匹配加A反应后的DNA分子两端可能具有的各种不同结构，能够显著增加DNA分子与接头的连接效率，从而不再受到加A反应效率的影响，从根本上提升文库构建效率。【附图说明】[0019]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。[0020]图1示出粘性末端接头混合物结构示意图。[0021]图2示出Y型结构接头混合物结构示意图。[0022]图3示出茎环结构接头混合物结构示意图。[0023]图4示出连接反应原理图。[0024]图5示出实施例1中连接反应电泳图；[0025]其中：泳道M:100bpDNALadder;[0026]泳道1:120bp片段加A产物+dsAdapterBlunt连接产物；[0027]泳道2:120bp片段加A产物+dsAdapterC连接产物；[0028]泳道3:120bp片段加A产物+dsAdapterT连接产物；[0029]泳道4:121bp合成含A片段+dsAdapterBlunt连接产物；[0030]泳道5:120bp合成含A片段+dsAdapterC连接产物；[0031]泳道6:120bp合成含A片段+dsAdapterT连接产物。[0032]图6示出实施例2中连接反应电泳图；[0033]其中：泳道M:100bpDNALadder[0034]泳道l:120bp片段加A产物+dsAdapterT连接产物；[0035]泳道2:120bp片段加Α产物+dsAdapterMix连接产物；[0036]泳道3:120bp片段加A产物+YAdapterMix连接产物；[0037]泳道4:120bp片段加A产物+S-LAdapterMix连接产物。【具体实施方式】[0038]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。[0039]实施例中所用的材料及来源分别力：￡Vw；>'7?;<^DNAPolymerase、2XPCRSuperMix(-dye)、IHPurificationKit、T4DNALigase(北京全式金生物技术有限公司），ADNA(Takara公司），引物合成、测序（Lifetechnologies公司）。[0040]实施例1:验证DNA加A反应产物具有不同的末端结构。[0041]1.扩增DNA片段并加3'dA[0042]以ADNA为模板，设计引物以扩增长度为120bp的目的片段。PCR引物为5'磷酸化引物，序列如下：[0043]120bpPrimerF:5'-GAGGATGACTGCTGCTGC-3'（见序列表SEQIDNo.l)120bpPrimerR:5'-GGTATCCCAGGTGGCCTG-3'（见序列表SEQIDNo.2)PCR反应体系如下：[0047]PCR结束后，取5μ1于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用PCRPurificationKit纯化PCR产物。用分光光度计定量。[0048]接下来对PCR产物加3'dA，反应体系如下：[0050]然后用EiWyPwr/PCRPurificationKit纯化PCR产物。用分光光度计定量。[00511产物记名为"120bp片段加A产物"。[0052]2.合成DNA片段[0053]合成两条长度为121nt的5'磷酸化的单链DNA，序列如下：[0054]121bpF：[0058]将这两条单链DNA退火，退火反应体系如下：[0060]退火产物条件为:95°C5分钟，缓慢冷却至室温。取ΙμL于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0061]退火产物为1条120bp的双链DNA，片段两端各带1个3'dA尾。此片段中120bp的双链部分，其序列与步骤1中的PCR产物序列完全相同。[0062]产物记名为"121bp合成含A片段"[0063]3·制备双链DNA接头[0064]合成4条单链DNA，序列如下：[0073]将AdapterTForwarcUAdapterCForwarcUAdapterBluntForward分别与AdapterReverse进行退火，构建3个接头，退火反应体系如下：AdapterT/C7BluntForward(100μΜ)5μΙAdapterReverse(100μΜ)5μIC〇〇74]0.5ΜTris-HClρΗΒ.Ο1μLddΗ2039μL[0075]退火产物条件为:95°C5分钟，缓慢冷却至室温。取ΙμL于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0076]3个退火反应的产物为3种双链DNA接头，其一端均为3'端4个G碱基的粘性末端(其目的是确保这一端不会与加Α后的PCR产物或合成的DNA片段相连接），而另一端分别为3'dT突出端、3'dC突出端、平末端。[0077]这3种双链DNA接头记名为"dsAdapterT"、"dsAdapterC"、"dsAdapterBlunt'，。[0078]4.片段+接头连接反应[0079]将步骤1、2中获得的"120bp加A片段"、"121bp合成片段"分别与步骤3获得的3个接头"dsAdapterT"、"dsAdapterC"、"dsAdapterBlunt"相连接，共计6个连接反应。反应体系如下：5XT4DNALigaseBuffer4μLT4DNALigase1μ![0080]120bp片段加A产物/121bp合成含A片段500ngAdapterT/C/B!unt500ngddH20加牟20μL[0081]反应条件为:25°C，2小时。[0082]反应结束后，各取10μ1产物于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图5所示。[0083]实施例2:比较本发明介绍的方法与使用传统接头的建库方法之差异。[0084]1.扩增DNA片段并加A[0085]同实施例1中步骤1[0086]2·制备双链DNA接头[0087]同实施例1中步骤3[0088]3.制备Y型结构DNA接头[0089]合成1条单链DNA，序列如下：[0090]YAdapterReverse：[0092]将AdapterTForwarcUAdapterCForwarcUAdapterBluntForward分别与YAdapterReverse进行退火，构建3个接头，退火反应体系如下：AdapterT/C/BIuntForward(100μΜ)5μIΥAdapterReverse(100uM)5μL[0093]·0.5MTris-HCIρΗ8.01μIddΗ2039u.i[0094]退火产物条件为:95°C5分钟，缓慢冷却至室温。取ΙμL于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0095]3个退火反应的产物为3种Υ型结构DNA接头，其一端为2条不互补的单链构成的Υ型结构(其目的是确保这一端不会与加Α后的PCR产物或合成的DNA片段相连接），而另一端分别为3'dT突出端、3'dC突出端、平末端。[0096]这3种接头记名为"YAdapterT"、"YAdapter0-、"YAdapterBlunt"。[0097]4.制备茎环结构DNA接头[0098]合成3条单链DNA，序列如下：[0105]将S_LAdapterTF_R、S_LAdapterCF_R、S_LAdapterBluntF-R分别进行自身退火，构建3个接头，退火反应体系如下：[0106]S-LAdapterT/C/BluntF-R(lOOyM)10μ1[0107]0.5ΜTris-HCIρΗ8.0ΙμL[0108]ddΗ2039μ1[0109]退火产物条件为:95°C5分钟，缓慢冷却至室温。取ΙμL于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0110]3个退火反应的产物为3种茎环结构DNA接头，其一端为2个C碱基的环状结构(其目的是确保这一端不会与加Α后的PCR产物或合成的DNA片段相连接），而另一端分别为3'dT突出端、3'dC突出端、平末端。[0111]这3种接头记名为"S_LAdapterT"、"S_LAdapter0-、"S_LAdapterBlunt"。5·制备接头混合物[0112]将步骤2中获得的3种接头"dsAdapterT"、"dsAdapterC"、"dsAdapterBlunt"等摩尔比混合，记为dsAdapterMix。[0113]将步骤3中获得的3种接头"YAdapterT"、"YAdapterC"、"YAdapterBlunt"等摩尔比混合，记为YAdapterMix。[0114]将步骤4中获得的3种接头"S-LAdapterT"、"S-LAdapterC"、"S-LAdapterBlunt"等摩尔比混合，记为S_LAdapterMix。[0115]6.片段+接头连接反应[0116]将步骤1中获得的"120bp加A片段"分别与步骤3获得的双链DNA接头"dsAdapterT"、步骤4获得的3种接头混合物"dsAdapterMix"、"YAdapterMix"、"S_LAdapterMix"相连接，共计3个连接反应。反应体系如下：[0117]5x74DNALigascBuffer4μL?4DNALigase1μL120bp片段加A产物500ngdsAdapterT/dsAdapterMix/?AdapterMix/S-LAdapterMix500ngddH20加申.20μ1[0118]反应条件为:25°C，2小时。[0119]反应结束后，各取1〇μ1产物于2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图6所示。[0120]比较结论[0121]1、本发明的实施例1显示，人工合成的末端100%带有3'dA突出端的DNA片段，仅能连接3'dT突出端的接头;而与之相比，加A后的DNA片段则可以与3种接头(3'dT突出端、3'dC突出端、平末端）均发生连接，证明了加A反应是一个低效率反应，反应产物中是3'dA突出端、3'dG突出端、平末端3种产物的混合体。[0122]2、本发明的实施例2显示，使用3种末端结构接头的混合物，其与加A后DNA片段的连接效率远远高于具有单一3'dT突出端结构的传统接头，且片段两端均与接头连接的成功率有显著提升。[0123]综上，本发明与传统方法相比，可以显著提升DNA接头的连接效率。[0124]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。【主权项】1.一种高效的接头连接方法，其特征在于，该方法包括:使用A型DNA聚合酶或DNA聚合酶Klenow片段处理DNA分子以添加3'dA突出端，再将处理后的DNA分子与接头混合物进行连接，得到连接产物，其中，所述接头混合物包括三种双链DNA接头，它们的一端分别为平末端、3'dT突出端和3'dC突出端。2.根据权利要求1所述的一种高效的接头连接方法，其特征在于，所述三种双链DNA接头的另一端为粘性末端。3.根据权利要求1所述的一种高效的接头连接方法，其特征在于，所述三种双链DNA接头的另一端为两条不互补的单链末端。4.根据权利要求1所述的一种高效的接头连接方法，其特征在于，所述三种双链DNA接头的另一端为茎环结构。5.根据权利要求1所述的一种高效的接头连接方法，其特征在于，所述DNA分子为PCR产物、二代测序建库过程中经过打断与末端修复的DNA片段或直接提取并经过修复的DNA片段。6.根据权利要求1所述的一种高效的接头连接方法，其特征在于，所述双链DNA接头通过两条反向互补的单链DNA退火制备，或通过一条两端具有互补序列的单链DNA退火制备。【文档编号】C12N15/10GK105950612SQ201610537963【公开日】2016年9月21日【申请日】2016年7月8日【发明人】耿亮,辛文【申请人】北京全式金生物技术有限公司