无创产前诊断技术之“哼哈二将”

作者：杨超月

小孩子到了一定年纪，都会对自己从哪里来产生兴趣，这个问题往往让父母支支吾吾、闪烁其词。廖信忠在《我们台湾这些年》提供了一个答案，印象深刻。他妈妈当年这么回答，大意是：爸爸给妈妈打了一针就有了你，颇具禅机。

王小平在《我的兄弟王小波》“写在前面”的部分对遗传因子的描述很得要领：“一个人本质上相当于一个万花筒。在出生之前，这个万花筒被造物之手簸动，衍生出难以计数的花纹。但一旦出生，此图案就此凝结”。遗传病本质上就是凝结成的图案有了瑕疵，这个过程从进化的角度看再自然不过，但对个人和家庭着实不幸。

听同事说她一个朋友孩子出生的时候，作为医生的父亲关心的不是宝宝是男是女，而是先检查娃娃十个手指，十个脚趾是否齐全。那些迎接宝宝降临人间的父母们，心态估计就像《阿甘正传》里面那句经典台词：生命就像一盒巧克力糖，你永远不知道盒里乾坤。

好在母体内胎儿游离DNA的发现，为无创产前检测提供了更多的可能。DNA分子计数技术的出现、成熟与广泛使用，使得对胎儿游离DNA的检测达到前所未有的精度，从而实现对不同遗传疾病的检测，无论是单基因遗传病还是染色体的非整倍性疾病。本期推荐由香港中文大学Dennis Lo实验室的Allen Chan教授撰写的综述，介绍数字PCR和NGS（深度测序对每个DNA分子进行序列读取，当然也可以看成是一种核酸层面的计数技术）这两种DNA分子计数技术在NIPT方面的应用及带来的影响。

早期发展

1997年，Dennis Lo通过普通PCR扩增的方法证明了胎儿游离DNA的存在，该发现奠定了日后通过母体血浆中胎儿游离DNA的分析进行NIPT的基础。早期对胎儿游离DNA的检测主要集中在对父源性特异序列的定性分析，如果在母体血浆中检测到这些靶标序列，那就证明胎儿经遗传获得了父本的特异性序列。该策略的一个早期应用是通过RHD基因的序列分析进行Rh阴性血怀孕妇女的监控。

目前通过对父源性血浆游离DNA的分析进行NIPT，已经扩展到常染色体显性遗传类疾病，如软骨发育不全、肌强直性营养不良和亨廷顿氏舞蹈症等。但该策略不能应用于其他遗传模式的疾病，诸如母源性导致的常染色体显性遗传类疾病、常染色体隐性遗传类疾病和染色体的非整倍性疾病。因为这些情况下，无论胎儿是否获得致病序列，在血浆内都能检测到来源于母亲本身的靶标序列。因此需要更精确的检测技术及更强大的数据处理方式。

DNA分子的“数字式”计数

数字PCR对DNA在单分子层面的绝对计数流程与工作原理见下图。在数字PCR之前，广泛采用的荧光定量PCR通过Ct值对核酸进行定量计算，这种定量方法的理论依据是在每轮PCR循环后PCR的扩增产物翻倍，因此荧光定量PCR最小能分辨2X差异的情形。数字PCR采用计数的方式进行定量，因此检测精度更高，甚至根本不需要荧光定量PCR检测中需要的标准品。（数字PCR技术的原理、发展历程、操作流程及大致应用在本公众号的第一期和第二期有详细的介绍）

不同的数字PCR设备

早期的数字PCR往往手工进行反应体系的partition，一般在几百个partition number的水平，耗时且操作繁琐。目前越来越多的商业化数字PCR平台面市，实现了该技术的高通量、自动化。不同厂商的设备及主要性能见下表。

Fluidigm最早采用微流控芯片的方式实现了商业化的数字PCR，partition number接近1000，但该方式成本较高，尤其对于常规的临床检测而言。之后面市的基于“油包水”方式的微滴式数字PCR使用成本更低，相信在NIPT领域比微流控芯片的数字PCR有更好的应用前景。原文引述如下：

As the marginal cost for generating droplets is low, droplet digital PCR systems have gained popularity over microfluidic chip digital PCR system in NIPT service.

大规模平行测序（Massive parallel sequencing, MPS）

对于NIPT，MPS是一种有力的工具，能在一个反应里对血浆中成百万的DNA进行测序。数字PCR实验方案的设计需要以明确的靶序列信息为前提，而MPS完全不需要，这尤其使得MPS在染色体非整倍性疾病的分析方面具有优势。但目前来看，MPS在实验成本及检测时间上不如数字PCR。原文引述如下：

This characteristic is of advantage over multiplex digital PCR for analyzing different chromosomal regions simultaneously, making MPS particularly useful for aneuploidy detection. However, MPS is still much more expensive than digital PCR, and the turnaround time of analyzing a sample takes longer than digital PCR.

胎儿DNA浓度的测定