【学术前沿】Cell Regen l 利用PAM

作者：张馨予

Cell Regeneration 的基因编辑与干细胞专辑由中国科学院分子与细胞卓越创新中心的李劲松教授和中国科学院广州生物医药与健康研究院的赖良学教授主持，特邀多位干细胞领域专家从不同角度对CRISPR/Cas技术在干细胞及再生医学领域中的应用进行了回顾、总结、探讨与展望。

即日起，我们将陆续推出Cell Regeneration基因编辑与干细胞专辑系列文章，敬请关注。

RESEARCH ARTICLE

CRISPR-Cas系统可以实现基因组编辑，因其功能强大而被誉为新一代的遗传学工具，并已广泛应用于生物研究和临床前疾病治疗。CRISPR的靶向特异性由两部分决定的，一是向导RNA和靶DNA之间的碱基配对，二是Cas9蛋白对特定短DNA序列的识别——这种短DNA序列常见于靶DNA的3'末端或者5'末端，被称为间隔序列前体临近基序PAM。因此，PAM决定Cas蛋白的DNA靶标识别机制是CRISPR-Cas系统的一个关键特征。

PAM是细菌CRISPR-Cas系统区分自身与入侵的外源DNA的依据，防止系统切割自身的基因组。研究人员已将CRISPR-Cas9系统应用于人类基因组编辑工作。如果没有PAM（功能性PAM），Cas酶将无法识别并有效切割所需的DNA片段，即无法编辑相应的靶序列。但是，如何在人类细胞中直接鉴定功能性PAM仍然是一个挑战。

温州医科大学附属眼视光医院眼视光学院，眼视光学和视觉科学国家重点实验室谷峰课题组在Cell Regeneration上发表了题为“Efficient cleavage resolves PAM preferences of CRISPR-Cas in human cells”的研究文章。文中，研究人员开发了一个正向筛选系统，即PAM-DOSE——用来鉴定人类细胞中功能性PAM。通过这个系统，研究人员研究了多个CRISPR-Cas家族成员的功能性PAM，并且发现间隔序列会影响这些功能性PAM的偏好性。

研究人员首先以SpCas9为例，通过双荧光报告库证实了通过PAM-DOSE系统确定人类细胞中CRISPR-Cas功能性PAM的可行性。在后续研究中，应用PAM-DOSE系统发现了SpCas9在人类细胞中功能性PAM偏好差异，也确定了Cas12a的功能性PAM。

SpCas9是基因组编辑研究中最常用的Cas蛋白之一，5'-NGG-3'为其有效PAM。这一特点是限制SpCas9广泛应用于基因组编辑（包括用于基因调控的dSpCas9）。SpCas9的突变体SpCas9-NG被报道能将5'-NG-3'识别为有效PAM，同时具有较高的切割活性和保真性。研究人员以Neo2和Zeo为靶序列，探究SpCas9-NG在人类细胞中功能性PAM偏好。结果显示，SpCas9-NG的功能性PAM是5'-NG-3'，同时，5'-NA-3'可以作为人类细胞中非典型功能性PAM。

CRISPR/Cas基因编辑系统在干细胞领域中的应用

综上，本研究开发的PAM-DOSE系统可用于解析CRISPR-Cas家族成员的功能性PAM，并有望用于新的基因编辑工具的研发。

Cite this article：

Xie, H., Liu, X., Fu, J. et al. Efficient cleavage resolves PAM preferences of CRISPR-Cas in human cells. Cell Regen. 8, 2 (2019). https://doi.org/10.1016/j.cr.2019.08.002

通讯作者

谷峰，温州医科大学附属眼视光医院、眼视光学院，视觉科学国家重点实验室、教育部重点实验室教授。研究方向为新型基因编辑技术及应用；人类胚胎干细胞定向分化；常见遗传病的致病基因鉴定与致病机理。

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2019年，《细胞再生》Cell Regeneration 经过了编辑队伍和期刊方向调整等大动作后，再度出现在学界同仁的视线中。该杂志是中国细胞生物学学会的官方出版物，采取开放获取OA的出版模式，在学会支持下目前不向作者收取发表费用APC；致力于促进领域内科学家发表研究成果、交流科研心得，助力推动干细胞和再生医学的基础研究及其向临床的转化。

2020年，中国细胞生物学学会携手SpringerOpen共同出版《细胞再生》，共同打造高质量的出版平台，为广大作者和读者提供更好的服务。

原标题：《【学术前沿】Cell Regen l 利用PAM-DOSE系统研究CRISPR-Cas在人类细胞中的PAM偏好性》