攻克“免疫共沉淀”，没点儿小心机怎么行？

作者：张馨予

科研||攻克“免疫共沉淀”，没点儿小心机怎么行？

2017-11-29 17:00 来源:东澳生物

原标题：科研||攻克“免疫共沉淀”，没点儿小心机怎么行？

免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）抗体和抗原之间的专一性为基础，用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

实验步骤

1.细胞转染后 24～48 h收蛋白，将细胞培养皿放于冰上，用预冷PBS洗三次。加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解10 min。用细胞刮轻轻刮下细胞，用移液枪将细胞裂解液转移至干净EP管中，冰上轻轻吹打，避免气泡产生。然后于4 ℃离心机，最大转速离心13000rpm，离心10 min 后取上清。

2.取少量裂解液转移至干净EP管中，以备 Western blot 分析。剩余裂解液加100ul相应的带有X抗体琼脂糖珠加入到细胞裂解液，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜。

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3.免疫沉淀反应后，在 4 ℃以 3 000 rpm 速度离心5min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，管底的琼脂糖珠用预冷PBS洗三次。然后加入500ul裂解缓冲液，最后加入125μl 的5× SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟,以游离抗原、抗体、珠子。4 ℃离心机，最大转速离心 10 min，取上清。

4. 取上清进行蛋白免疫印迹实验，确定结合蛋白。

注意事项

1.细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。

2.免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到。

3.由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP。

4.得到了复合物，实验就大功告成啦？哪有这么简单。 CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测。

5.为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员。

7个关键控制点

1.有效裂解细胞。

2.恰当选择处理样本的方式：超声或酶处理。

3.选用适当适量抗体。

4.恰当设置对照。

5.不要过分交联DNA-蛋白质。

6.交联所用的甲醛终浓度约为1%，交联时问需要预实验来确定。

7.注意PCR策略具体来说：恰当设置chip实验对照，设置适当的阳性和阴性对照是进行ChIP结果分析的重要步骤和Trouble shooting的依据，因为非特异性的免疫沉淀难以避免。