聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

乙型肝炎病毒(HBV)感染时，外周血中HBV DNA是病毒复制最直接和可靠的标志。自1985年以来，国外应用核酸分子杂交法、定量聚合酶链反应(PCR)法检测HBV DNA含量［1］，国内也有一些报道［2］。北京佑安医院自1996年1月至1997年8月采用美国Biotronics公司新型HBV定量PCR检测仪，依据荧光素标记引物在扩增中能量转换原理对模版DNA进行定量检测，共检测约2 000例次标本。我们选择其中271例临床资料完整病例进行方法的灵敏性、实用性及临床应用价值的探讨，并通过综合分析，对乙型肝炎血清标记物进行评价。

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象　251例病例为北京佑安医院1996年1月至1997年8月的乙型病毒性肝炎住院患者，共251例，男131例，女120例，平均年龄39.1±12.7岁。其中急性肝炎14例，慢性肝炎108例，肝炎后肝硬化17例，妊娠肝炎21例，妊娠HBsAg携带者91例。诊断符合1995年5月北京第五次全国传染病和寄生虫病会议讨论修订的病毒性肝炎诊断方案(试行)。另外检测并比较了妊娠肝炎3例、妊娠HBsAg携带者17例母亲及其所生新生儿脐带HBV DNA含量。

　　1.2　乙型肝炎病毒血清学检测方法　HBVM的检测用ELISA法，试剂由Abbort公司提供。HBV DNA的检测用斑点杂交法，试剂由北京医科大学肝炎研究所生产。

　　1.3　HBV DNA定量聚合酶链反应检测采用美国Biotronics公司建立的HBV DNA定量PCR检测法［3］，该试验的灵敏度为104 copy/ml，本组病例均以＜1×104copy/ml为阴性结果。为便于统计，均以检测结果绝对值的对数值进行比较。

　　1.4　质量监控　每次实验各设阳性、阴性和最大信号对照，每份标本取两孔均值计算结果，并严格参照Kwok［4］等提出的防污措施进行实验操作。

　　1.5　肝功能检测　采用COBAS血自动生化分析仪检测，ALT＞40 U/L，TBil＞17.1 μmol/L(1.0 mg/dl)为异常。

　　2　结果

　　2.1　按病型分析HBV DNA定量检测结果　急性乙型肝炎检测14例，13例(92.9%)阳性，其平均对数值为6.33±1.00 copy/ml；慢性乙型肝炎检测108例，100例(92.6%)阳性，其平均对数值为6.35±1.08 copy/ml；肝炎后肝硬化检测17例，16例(94.1%)阳性，其平均对数值为6.53±1.08copy/ml；肝炎后肝硬化检测17例，16例(94.1%)阳性，其平均对数值为6.53±0.96 copy/ml。经统计学处理，慢性肝炎、急性肝炎和肝硬化患者的HBV DNA定量三者间没有明显差异(P＞0.05)。

　　2.2　慢性肝炎的HBV DNA定量与HBVM检测结果的关系　从表1可以看出，除1、3、5项阳性外，其余HBVM的各种表现形式中，均可存在不同程度的病毒复制，对HBVM临床意义的认识需进行观念更新，1、3、5项阳性组HBV DNA定量结果均值明显高于其它组，但本组均数标准差极大，表明不同个体复制程度差别较大，HBVM的6种表现形式中，HBV DNA的定量结果数值统计学差异不明显，考虑可能与本法为扩增法，非原实际数值及均值标准差大有关，HBVM均阴性者，HBV DNA定量仍可阳性，表明HBVM均阴性者，并不能排除乙型肝炎病毒感染。

表1　108例慢性乙肝患者HBV DNA定量与HBVM检测结果的比较

HBVM 例数定量结果(copy/ml) 定量结果对数值检测阳性率%
1,3,5项阳性 21 (235.9±979.16)×106 6.64±1.11* 100。0(21/21)
1,4,5项阳性 21 (7.85±15.05)×106 6.12±0.93** 95.2(20/21)
1,5项阳性　8 (4.42±8.93)×106 5.69±1.19# 85.7(7/8)
2,4,5项阳性 21 (10.29±16.50)×106 6.17±1.13 85.7(18/21)
5项阳性 11 (77.53±233.16)×106 6.56±1.22 90.9(10/11)
阴性 14 (14.28±20.18)×106 6.71±0.72## 不便统计
4,5项阳性 12 (13.28±15.91)×106 6.40±1.23 83.3(10/12)
合计 108 (60.95±436.52)×106 6.35±1.08 92.6(100/108)

　　注：1为HBsAg；2为抗-HBs;3为HBeAg;4为抗-HBe;5为抗-HBc.#示达到＞1×104值

　　copy/ml的百分比.

　　*∶#，**∶##，#∶##比较，P＜0.05

　　2.3　妊娠合并病毒性肝炎患者与妊娠HBsAg携带者及其新生儿脐带血HBV DNA定量检测结果的关系　见表2和表3。从表2看出，妊娠患者肝功能正常，HBVM1、3、5阳性者其HBV DNA定量值明显高于1、4、5阳性者(P＜0.001)，而肝功能正常与否对HBV DNA定量的高低无明显影响(P均＞0.05)。母亲HBV DNA定量结果与其新生儿基本一致，且其母亲的平均值稍高于其子女(P＞0.05)；HBeAg阳性母亲与其新生HBV DNA的均值亦高于HBV DNA阴性的母亲与其新生儿(各自分别为其10.4与4.3倍)，表明无论HBeAg阳性或阴性母亲均可将HBV传染给组新生儿，但前者的可能性更大。

表2　92例妊娠肝病患者HBVM及肝功能与HBV DNA定量的关系

BHVM 例肝功能正常组肝功能异常组合计
(±s)(对数值) n (±s)(对数值) n (±s)(对数值)
1,3,5项 47 7.01±1.46* 14 6.70±1.02 61 6.94±1.39#
1,4,5项阳性 27 5.31±1.30** 4 6.22±1.14 31 5.42±1.30##
合计 74 6.39±1.63 18 6.59±1.03 92 6.43±1.53

　　注：*∶**比较，t=5.03,P＜0.001;#∶##，t=5.153,p＜0.001;(±s)的实际数值从略

表3　HBeAg阳性与HBeAg阴性母亲所生新生儿脐带血HBV DNA定量比较

检测对象例数 HBeAg阳性(copy/ml) 例数 HBeAg阴性(copy/ml)
母亲 14 (94.01±186.83)106 6 (9.07±20.07)×106
　　 6.49±1.61* 　 5.98±1.01*
新生儿 14 (34.64±65.32)×106 6 (7.99±15.80)×106
　　 6.36±1.41* 　 5.79±1.35*

　　注：*为均数之对数值；母亲组和新生儿组比较，HBeAg阳性组和阴性组比较P均＞0.05

　　3　讨论

　　3.1　HBV DNA定量新方法的可靠性、优越性及其在临床科研中的应用价值　由美国Biotronics公司建立的新型HBV DNA定量检测方法，属于外参标定量PCR技术，原理已有文章论述［3，5］，本方法不同于旧方法的是其在密闭的环境中进行，不需传统电泳程序，用计算机自动分析定量，其结果是可靠的，可以克服PCR定性假阳性的弊病［5］。本组研究的271例结果亦有一定的规律性，如在妊娠母亲HBeAg阳性者HBV DNA定量结果明显高于HBeAg阴性者。表明此竞争扩增法是真实、可靠的，在临床科研中主要是在评价抗病毒药物临床疗效方面是一个很好的指标。

　　3.2　对HBVM临床意义的再认识　既往传统观念认为，抗-HBs的出现表示病毒已清除，但已有学者证明乙型肝炎抗-HBs出现后血清内仍有DNA复制，但随时间推移，HBV DNA检出率逐渐下降，Loriot［6］等采用PCR法动态观察慢性乙型肝炎病人血清HBsAg至抗-HBs转化后HBV DNA的变化，抗-HBs出现后的2个月58%的病人血清HBV DNA阳性，6个月时31%阳性，12个月时15%阳性(此时血清抗-HBs滴度均＜10 IU/L)。Kaneko等［7］以黑猩猩作实验证实，HBsAg消失、抗-HBs出现后血清中HBV DNA至少持续存在3周。国内外学者还证明［7～9］，单纯抗-HBc阳性者中，在首先除外假阳性后，确有部分为HBV低水平复制，包括急性乙型肝炎感染空窗期；自然感染后抗-HBs滴度下降无法检出；被动获得的自然感染后(如输入抗-HBc阳性血)的3种情况［7～9］，本组结果均与上述观察一致。国内外学者［10，11］用PCR法检测HBsAg阴性、肝功能正常者，发现相当部分HBsAg阴性的慢性肝病患者不仅是HBV感染者，而且有病毒复制和传染性。因此骆抗先等明确指出，血清中未检出HBsAg并不能除外HBV感染，一些临床诊断的非甲～非戊型肝炎，除庚型肝炎外，更多的是血清学阴性的HBV感染［9］。有人还证实可能是HBVS基因变异［12］或HBsAg低水平表达所致。本文14例HBVM均阴性的患者HBV DNA定量为14.4×106，全部经斑点杂产法检测为HBV DNA阳性，亦证实了此观点的正确性。

　　3.3　HBV定量检测结果对母婴传播的再认识　既往认为，在乙型肝炎母婴传播中，HBsAg阴性母亲很少引起围产期传播［13］。但新近利用PCR技术发现的HBsAg阴性母亲的宫内传播，提示须对过去的概念重新审定［14］。本文资料具有明确的HBV DNA定量结果，进一步证实了上述新概念，亦表明，产后对HBeAg阳必或阴性母亲所生新生儿进行计划免疫同样重要。

　　参考文献

　　1　Wu J W, Sullivan D E, Gerben M A. Quantitative polymerase chain reaction for hepatitis B virus DNA. J Virol Methods, 1994,49:331-332.

　　2　张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV-DNA及其临床应用技术.中华传染病杂志，1997，15(1)：24-27.

　　3　黄德庄，张建成，贺丽香，等.定量聚合酶链反应检测乙型和丁型肝炎患者HBV-DNA.当代医师杂志，1996，12：7-9.

　　4　Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989,339(6221):237-238.

　　5　黄呈辉.HBV DNA定量检测及临床应用的研究.国外医学流行病传染病分册，1996，23(4)：154-157.

　　6　Loriot M A, Marcellin P, Bismuth E, et al. Demonstration of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction in the serum and the liver after spontaneous or therapeuticauy induced HBeAg to anti-HBe or HBeAg to anti-HBs seroconversion in patients with chronic hepatitis B. Hepatology, 1992,15(1):32-36.

　　7　Kaneko S, Miuer R H, Di Bisceglie A M, et al. Detection of hepatitis B virus DNA in serum by polymerase chain reaction: application for clinical diagnosis. Gastroenterology, 1990,99:799-804.

　　8　张树林.乙型肝炎血清标志意义再认识.国外医学流行病传染病分册，1993，2：57-61.

　　9　骆抗先，闵佳，何海棠，等.单一抗HBc阳性个体的血清传染性和随访.肝脏病学杂志，1994，03；2(1)：5-7.

　　10　骆抗先，杨洁，张智，等.HBsAg(一)慢性HBV感染：S基因a表位无娈异.肝脏病杂志，1994，2(3)：144-146.

　　11　Brechot C, Kremsdorf D, Paterlin P, et al. hepatitis B virus DNA in HBsAg-negative patients. J Hepatol, 1991,13(suppul 4): S49-55.

　　12　Lai M E, MAzzdeni A T, Tocco A, et al. Sequency analysis of hepatitis B viruse mutants isolated in Sardinia in HBsAg negative chronic hepatitis. Hepatology, 1991,14(4pt2):210A.

　　13　邢玉兰，高寿征.乙型肝炎的流行病学和预防研究.见：高寿征，主编.病毒性肝炎.北京：北京出版社，1993，27.

　　14　徐志一.流行率.流行环节.见：骆抗先，编著.乙型肝炎－基础和临床，北京：人民卫生出版社，1997，163.